番茄斑萎病毒和水稻黑條矮縮病毒CP和RdRp的轉(zhuǎn)基因煙草構(gòu)建.pdf

1、水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV）可侵染水稻、玉米、小麥等禾本科作物，引起水稻黑條矮縮病、玉米粗縮病等病害。其基因組有10條雙鏈RNA（ S1-S10）， S1編碼RNA依賴的RNA聚合酶（ RdRp）， S10編碼外殼蛋白（CP）。番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）能夠侵染70科900多種植物，病害在世界范圍內(nèi)都有分布。其基因組包

2、括三條單鏈RNA（L、M和S）；RNA L為負(fù)義RNA，其互補(bǔ)鏈編碼RNA依賴的RNA聚合酶（ RdRp）， RNA S為雙義RNA，其互補(bǔ)鏈編碼核衣殼蛋白（N）。這兩種病害均可造成嚴(yán)重的生產(chǎn)危害和經(jīng)濟(jì)損失，為進(jìn)一步對(duì)這兩種RNA病毒進(jìn)行分子生物學(xué)水平研究，本研究旨在構(gòu)建含有TSWV和RBSDV CP和RdRp蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草，嘗試建立其反向遺傳學(xué)體系。
　　基于雙元載體pROKⅡ，構(gòu)建了分別含有RBSDV和TSWV CP和RdR

3、p的pROKⅡ-TS-CP、pROKⅡ-TS-CP-8H、pROKⅡ-RB-CP、pROKⅡ-RB-CP-8H、pROKⅡ-TS-RdRp、pROKⅡ-TS-RdRp-8H、pROKⅡ-RB-RdRp、pROKⅡ-RB-RdRp-8H等8個(gè)不帶His標(biāo)簽或帶His標(biāo)簽的轉(zhuǎn)基因載體。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法分別將8個(gè)載體轉(zhuǎn)化普通煙（Nicotiana tabacum, NC89），普通煙葉片經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)，篩選出抗性愈傷組織，