己糖激酶2在喉鱗狀細(xì)胞癌中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、第一部分己糖激酶2在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)和臨床意義
　　背景和目的:喉癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一,其中絕大多數(shù)為喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)。喉癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢。這促使我們?nèi)ド钊胙芯縇SCC的病因和發(fā)病機(jī)制。與正常細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞的能量代謝改變?nèi)鏦arburg效應(yīng)在腫瘤增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。己糖激酶(Hexokinase,HK)是糖酵解途徑中第一個反應(yīng)的限速酶,研究發(fā)現(xiàn),己糖激酶2(HK2)與惡性腫

2、瘤關(guān)系最密切,在多種人腫瘤組織中表達(dá)升高。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn),HK2與線粒體外膜結(jié)合后可促進(jìn)Warburg效應(yīng),并可能抑制線粒體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來促使腫瘤生長,因此被認(rèn)為是干預(yù)腫瘤生長的理想分子靶點。目前HK2與頭頸部鱗癌(HNSCC)發(fā)生發(fā)展的關(guān)系僅有零星報道,發(fā)現(xiàn)其可能在HNSCC中呈高表達(dá),但缺乏深入的研究報道。本部分旨在研究HK2在LSCC中的表達(dá)特點,并分析其表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系,探尋其臨床意義。并在后續(xù)的研究中分析HK2的對腫瘤

3、增殖及凋亡的影響。
　　方法:收集了108例LSCC原發(fā)灶、24例喉乳頭狀瘤和21例聲帶息肉的石蠟標(biāo)本,入組均為男性患者。應(yīng)用免疫組化的方法檢測HK2在上述組織的表達(dá)特點。HK2蛋白的表達(dá)結(jié)果據(jù)染色強(qiáng)度和陽性腫瘤細(xì)胞的百分比情況進(jìn)行綜合判定。并統(tǒng)計HK2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:LSCC與喉乳頭狀瘤或聲帶息肉組織中HK2表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001)。進(jìn)

4、一步分析發(fā)現(xiàn),HK2的表達(dá)與腫瘤部位(P<0.001)、臨床分期(P≤0.001)有關(guān)。在聲門上型LSCC標(biāo)本中,HK2多呈高表達(dá),而在聲門型LSCC中多呈中到低度表達(dá)。HK2表達(dá)隨腫瘤分期的升高而增加,在Ⅰ-Ⅱ期的組織多為中到低度表達(dá),在Ⅲ-Ⅳ期中多為高表達(dá)。HK2表達(dá)強(qiáng)度與年齡無關(guān)(P>0.05)。
　　結(jié)論:HK2在LSCC的表達(dá)較喉乳頭狀瘤或聲帶息肉升高。HK2的表達(dá)與LSCC部位及臨床分期有關(guān)。
　　第二部分靶向H

5、K2基因shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和干擾效率鑒定
　　目的:篩選HK2有效的干擾序列,為后續(xù)研究干擾HK2對喉癌細(xì)胞的增殖及凋亡影響打下基礎(chǔ)。
　　方法:按照RNA干擾靶點的設(shè)計原則,在BLAST網(wǎng)站進(jìn)行同源分析,從人HK2基因(NM_000189.4)編碼序列中尋找出特異性序列為靶點。并按shRNA的設(shè)計方法,在靶序列的5’端和3’端加入相應(yīng)的序列,并與線性化pGenesil-1.1質(zhì)粒表達(dá)載體相連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGe

6、nesil-1.1-HK2-1、pGenesil-1.1-HK2-2及pGenesil-1.1-control。重組質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)染人喉癌Hep-2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h小時后,分別測定各組細(xì)胞的HK2的mRNA及蛋白表達(dá),確認(rèn)HK2 shRNA瞬時轉(zhuǎn)染后的干擾效率。
　　結(jié)果:經(jīng)酶切鑒定和測序分析證實重組pGenesil-1.1-HK2-1、pGenesil-1.1-HK2-2及pGenesil-1.1-control構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒

7、轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞48h后,檢測HK2的mRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染組和對照組相比,pGenesil-1.1-HK2-1和pGenesil-1.1-HK2-2質(zhì)粒均顯著降低HK2 mRNA的表達(dá)(P<0.001);其中pGenesil-1.1-HK2-2干擾效率(58.7±3.06％)高于pGenesil-1.1-HK2-1的干擾效率(45.3±3.51%)(P<0.05)。檢測pGenesil-1.1-HK2-1、pGenesil-1.

8、1-HK2-2及pGenesil-1.1-control轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的蛋白表達(dá)變化與mRNA結(jié)果相一致。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了pGenesil-1.1-HK2-1、pGenesil-1.1-HK2-2及pGenesil-1.1-control重組質(zhì)粒,并在mRNA及蛋白水平證實pGenesil-1.1-HK2-1、pGenesil-1.1-HK2-2均可有效干擾HK2的表達(dá),后者干擾效率稍高,選擇用于后續(xù)試驗。
　　第三部分s

9、hRNA干擾HK2基因?qū)θ撕戆┘?xì)胞株Hep-2細(xì)胞凋亡和增殖的影響
　　目的:篩選shRNA干擾HK2的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,并在細(xì)胞水平研究shRNA干擾HK2對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法:G418篩選,有限稀釋法挑取單克隆細(xì)胞,形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGenesil-1.1-HK2-2和pGenesil-1.1-control的Hep-2細(xì)胞株HK2 shRNA及control shRNA。應(yīng)用qRT-PCR

10、及Western blot檢測HK2 shRNA及control shRNA的HK2 mRNA及蛋白的表達(dá),并利用6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)偶聯(lián)比色法測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的HK活性。應(yīng)用MTT法檢測shRNA干擾HK2對腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。用流式細(xì)胞儀檢測shRNA干擾HK2對腫瘤細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　結(jié)果:qRT-PCR及Western blot的結(jié)果顯示,與control shRNA和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,HK2 shRN

11、A組HK2 mRNA及蛋白表達(dá)下降(P<0.001)。G6PDH偶聯(lián)比色法檢測顯示,與control shRNA和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,HK2 shRNA組細(xì)胞的HK活性下降。MTT實驗發(fā)現(xiàn)shRNA干擾HK2能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖(p<0.05)。細(xì)胞周期檢測顯示shRNA干擾HK2能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生G0-G1期阻滯(P<0.001)。凋亡檢測發(fā)現(xiàn)shRNA干擾HK2能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡(P<0.05)。
　　結(jié)論:shRNA干擾HK

12、2可抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生G0-G1期阻滯,是一個潛在的癌基因。
　　第四部分shRNA干擾HK2基因?qū)θ撕戆┘?xì)胞株Hep-2細(xì)胞裸鼠成瘤效應(yīng)的影響
　　目的:研究shRNA干擾HK2對人喉癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力的影響,并探討對裸鼠移植瘤增殖和凋亡的影響。
　　方法:采用前期構(gòu)建成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HK2 shRNA質(zhì)粒的人喉癌細(xì)胞株Hep-2進(jìn)行裸鼠皮下移植瘤模型實驗。將18只BA

13、LB/c-nu裸鼠隨機(jī)等分成未轉(zhuǎn)染組、陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,均皮下注射2×106個細(xì)胞/鼠至裸鼠的右側(cè)前肋皮下。觀察腫瘤生長情況,定期記錄腫瘤的長短徑。4周后處死裸鼠,記錄瘤重。并將瘤體包埋做成石蠟切片,行HE染色、Ki-67染色及TUNEL檢測,了解在體內(nèi)水平HK2表達(dá)下降對腫瘤細(xì)胞異型性、腫瘤增殖及凋亡的影響。
　　結(jié)果:與未轉(zhuǎn)染組和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組裸鼠的腫瘤體積和瘤重明顯降低(P<0.05)。HE

14、染色顯示,與未轉(zhuǎn)染組和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞異型性現(xiàn)象有所減輕。腫瘤組織行Ki-67染色發(fā)現(xiàn),陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的增殖指數(shù)(46.71±5.17%)較未轉(zhuǎn)染組(70.30±4.92%)和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(67.14±4.76%)顯著降低(P<0.01)。TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn),陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的凋亡指數(shù)(39.45±8.80%)較未轉(zhuǎn)染組(16.67±6.56%)和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(19.57±7.16%)顯著升高(P<0.00