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1、本研究從實(shí)驗(yàn)室的突變體庫中,篩選得到兩個(gè)早衰突變體,分別命名為es7和pls5。隨后分別對(duì)其開展了表型分析、基因定位與克隆、基因功能分析等相關(guān)工作,獲得的主要結(jié)果如下:
1.通過60Co輻射誘變93-11種子,篩選得到一個(gè)水稻早衰突變體es7。在大田種植條件下,播種60天左右時(shí),下部葉片開始出現(xiàn)衰老,隨著植株的生長發(fā)育,衰老越來越嚴(yán)重。在高濃度二氧化碳條件下,光呼吸被抑制,es7表型可以得到恢復(fù)。生理指標(biāo)檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),es7突
2、變體中,有大量H2O2積累,并且過氧化氫酶活性顯著降低,植株總抗氧化能力降低;同時(shí)衰老相關(guān)基因表達(dá)量都顯著升高。圖位克隆和測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),在88kb范圍內(nèi),第9個(gè)ORF(LOC_Os07g46460)的第二個(gè)外顯子和內(nèi)含子銜接處(1292bp),有一個(gè)堿基發(fā)生了突變,由G突變?yōu)锳,導(dǎo)致mRNA缺失57個(gè)堿基,最終導(dǎo)致蛋白保守的purF-type谷氨酰胺轉(zhuǎn)移區(qū)域結(jié)構(gòu)異常。
ES7基因編碼一個(gè)鐵氧還原蛋白依賴的谷氨酸合酶(Fd-GO
3、GAT),是一個(gè)組成型表達(dá)的基因,并且其編碼的蛋白定位于葉綠體。熒光定量PCR分析顯示,在es7突變體中,很多氮代謝相關(guān)的基因表達(dá)量和酶活性都發(fā)生了改變,大部分游離氨基酸含量也顯著降低;并且葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)量也都顯著降低。另外,當(dāng)幼苗生長在濃度逐漸增加的NH4+條件下,葉綠素的含量依然顯著低于野生型。我們的研究結(jié)果表明,F(xiàn)d-GOGAT突變導(dǎo)致es7的早衰表型,該基因參與氮代謝,影響葉綠素的合成,并且可能參與光呼吸過程,最終影響葉
4、片衰老。
2.通過EMS誘變中恢8015(ZH8015)種子,篩選得到一個(gè)早衰突變體pls5。在播種60天左右,從pls5突變體下部葉片葉尖開始,出現(xiàn)黃化衰老干枯。隨著植株的生長發(fā)育,衰老葉片的數(shù)量、衰老的程度都逐漸增加。到抽穗期時(shí),衰老程度已經(jīng)很嚴(yán)重,除劍葉葉片,其他葉片的中上部都已經(jīng)明顯的衰老干枯。到灌漿期,幾乎整個(gè)植株都已經(jīng)衰老干枯。pls5突變體葉綠素含量顯著降低,光合作用降低,農(nóng)藝相關(guān)性狀受到影響,使單株產(chǎn)量顯著降低
5、。DAB、依文思藍(lán)染色、TUNEL實(shí)驗(yàn)以及生理指標(biāo)檢測(cè)顯示,pls5突變體中有過量H2O2積累,過氧化物酶活性降低,細(xì)胞死亡增加。葉片透射電鏡觀察顯示,pls5突變體葉綠體結(jié)構(gòu)異常,葉綠體降解加速。
遺傳分析表明,pls5早衰表型是由一個(gè)核隱性單基因控制。利用圖位克隆的方法,將該基因定位于5號(hào)染色體69.3kb范圍內(nèi),包含12個(gè)開放閱讀框。經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),在第七個(gè)開放閱讀框LOC_Os05g48060內(nèi),在633-643位置缺
6、失11個(gè)堿基,最終導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止。該基因編碼一個(gè)磷脂酰絲氨酸合酶,即OsPSS2(SUI2)。轉(zhuǎn)基因遺傳互補(bǔ)、RNAi等表明,pls5突變體的表型是由OsPSS2突變引起的。進(jìn)化分析顯示,該基因在不同的物種中同源性和保守性都很高。PLS5在水稻中組成型表達(dá),并且在沒有衰老的葉片中表達(dá)量較高;PLS5蛋白定位于細(xì)胞膜和核膜。葉綠素合成、降解以及光合作用相關(guān)基因表達(dá)量分析顯示,pls5突變體葉綠素合成受阻,葉綠體降解加速。同時(shí),離體和
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