家兔Oct4-EGFP報告系統(tǒng)的建立.pdf

1、家兔繁殖周期短、經(jīng)濟成本低、體型適中、便于操作，其生理特征和系統(tǒng)發(fā)育方面比嚙齒類動物更接近靈長類，兼顧大型實驗動物和小型實驗動物的優(yōu)點，已經(jīng)成為一種重要的生物醫(yī)學(xué)和動物發(fā)育機制研究模型。在很多情況下通過基因修飾的方法生產(chǎn)的動物模型能更真實地模擬人類疾病的發(fā)病機制，其中胚胎干細胞(EmbryonicStemCells，ESCs)結(jié)合嵌合體技術(shù)是獲得基因定點修飾動物的一種很有效的方法。然而具有生殖系嵌合能力的家兔ESCs系還未建立，這成為獲

2、得基因修飾兔的主要障礙。轉(zhuǎn)錄因子Oct-4(POU5fl)作為一種重要的多能性標(biāo)記因子，特異性表達于ESCs、原始生殖細胞(primordialgermcells，PGCs)等多能性細胞中，它在ESCs的多能性維持方面以及體細胞誘導(dǎo)重編程中起著至關(guān)重要的作用。利用Oct-4基因5‘端上游的調(diào)控區(qū)控制增強型綠色熒光蛋白基因(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的表達，建立Oct4-EGFP報告系統(tǒng)，可

3、實時監(jiān)測內(nèi)源Oct-4基因的表達，在研究多能性細胞的分化、體細胞的重編程方面有很重要的作用。目前，小鼠、人和豬的Oct4-EGFP報告系統(tǒng)已經(jīng)成功建立，并得到極為廣泛地應(yīng)用，但在家兔上卻未見報道。
　　 本實驗中我們從家兔基因組中擴增出Oct-4基因的5’-端上游的調(diào)控區(qū)，并構(gòu)建含有Oct4-EGFP表達框的載體(pROP-EGFP);然后通過電穿孔的方法將載體導(dǎo)入家兔胚胎成纖維細胞(rabbitfetalfibroblasts

4、，RFF)，獲得穩(wěn)定整合Oct4-EGFP的轉(zhuǎn)基因RFF系，并以該細胞系進行體細胞核移植;隨后將一部分核移植胚胎進行體外培養(yǎng)，另一部分核移植胚胎移到3只代孕受體中進行體內(nèi)發(fā)育。核移植胚胎體外發(fā)育至囊胚，我們選擇表達EGFP的囊胚進行抗Oct-4的胚胎免疫熒光染色，結(jié)果顯示Oct-4與EGFP在時空性表達上是一致的;核移植胚胎體內(nèi)發(fā)育至15天時，我們從2只懷孕的代孕受體母兔解剖分別獲得一枚胎兒。從胎兒中分離的生殖脊（含有原始生殖細胞）在倒