褐飛虱RDL亞基多態(tài)性分析及與氟蟲腈抗性之間的關系研究.pdf

1、褐飛虱Nilaparvata luges St(a)l（Brown planthopper,BPH）是危害水稻最嚴重的害蟲之一，生產(chǎn)上主要以化學防治為主。但是長期以來對化學藥劑的依賴，導致了褐飛虱對各種長期使用的常規(guī)殺蟲劑甚至新型的殺蟲劑都已經(jīng)產(chǎn)生了嚴重的抗性。氟蟲腈是防治褐飛虱的重要殺蟲劑之一，但是前期研究發(fā)現(xiàn)田間褐飛虱普遍對氟蟲腈的敏感性明顯下降，很多地區(qū)的田間種群甚至產(chǎn)生了高水平的抗性。為了進一步了解褐飛虱對氟蟲腈的抗藥性機制，建

2、立有效的抗藥性治理策略，提高藥劑的藥效和合理使用方法，本文通過田間褐飛虱的抗性生物測定、室內敏感品系的誘變、氟蟲腈高劑量篩選，分析篩選試蟲靶標基因序列的多態(tài)性變化，鑒定關鍵多態(tài)性位點，并通過外源表達分析了多態(tài)性位點對應的氨基酸變化對氟蟲腈敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)了GABA受體Rdl亞基的抗藥性相關的功能突變位點。具體結果匯報如下。
　　一、褐飛虱對氟蟲腈的抗藥性調查
　　對2010年采自南寧等12個地區(qū)的褐飛虱田間種群進行了抗藥性

3、監(jiān)測，并以室內連續(xù)飼養(yǎng)多年的敏感品系作為敏感基線，以改進的稻莖浸漬法作為生物測定方法。結果發(fā)現(xiàn)，12個田間褐飛虱種群均已對氟蟲腈產(chǎn)生了明顯的抗性，以南京等5個地區(qū)的抗性更為顯著，其中南京地區(qū)的田間褐飛虱種群對氟蟲腈的抗性已達到了65.74倍?？梢姡煌貐^(qū)褐飛虱種群均已經(jīng)對氟蟲腈產(chǎn)生了高水平抗性，部分地區(qū)抗性水平超過50倍，而且地區(qū)之間存在較大差異。這說明了田間褐飛虱種群對氟蟲腈抗性發(fā)展迅速。2010年褐飛虱對氟蟲腈抗性的快速上升，可能

4、與2007-2009年間氟蟲腈大量應用于褐飛虱防治有關，說明高效殺蟲劑的連續(xù)單一使用，很容易導致害蟲抗藥性的產(chǎn)生，與褐飛虱對吡蟲啉抗性發(fā)展相一致。
　　二、田間褐飛虱RDL亞基功能區(qū)氨基酸多態(tài)性分析
　　根據(jù)已有的褐飛虱Rdl亞基核苷酸序列設計特異性引物，并采用降落PCR與半巢式PCR相結合的技術擴增了褐飛虱室內敏感品系與28個不同地區(qū)的田間抗性種群GABA受體Rdl亞基功能區(qū)的cDNA片段，測序并進行序列對比分析。結果發(fā)現(xiàn)

5、，在檢測的28個地理種群中，有21個地區(qū)的種群發(fā)生了不同數(shù)量的氨基酸替換，并且有部分氨基酸多態(tài)性在不同地區(qū)的褐飛虱種群中都有發(fā)生。選取抗性水平較高、多態(tài)性較多的3個種群（福州、南京、重慶）進行了高劑量篩選和多態(tài)性變化研究，發(fā)現(xiàn)了R282Q、A284G、Y258S和A284S多態(tài)性在篩選后得到不同程度的增加，部分多態(tài)性發(fā)生在氟蟲腈結合區(qū)域（跨膜片段TM1-TM3）上，預示著這些氨基酸替換可能在抗藥性中起重要作用。
　　三、室內褐飛虱

6、誘變品系RDL亞基功能區(qū)氨基酸多態(tài)性分析
　　利用紫外照射和秋水仙素兩種誘變方法對室內褐飛虱種群進行誘變，并對誘變品系進行高劑量氟蟲腈篩選，然后對篩選出來的褐飛虱進行Rdl亞基功能區(qū)序列測定并與敏感品系序列相對比。結果在Rdl亞基的第二跨膜區(qū)域發(fā)現(xiàn)了2個氨基酸替換（R282Q和M293I），并且其中一個氨基酸替換(R282Q)在田間種群中也發(fā)生了同樣的突變。由此分析認為，這一突變很可能與褐飛虱膜蛋白的結合能力下降以及氟蟲腈靶標抗性

7、有關。
　　四、氨基酸多態(tài)性在褐飛虱對氟蟲腈選擇性中的影響
　　針對田間種群和誘變種群中發(fā)現(xiàn)的關鍵位點突變，在非洲爪蟾卵母細胞中進行敏感型和突變型Rdl受體表達，檢測Y258S、R282Q、A284S、A284G以及R282Q/A284S氨基酸替換對氟蟲腈敏感性的影響。利用雙電極電壓鉗記錄技術，記錄了突變對GABA反應和氟蟲腈對GABA反應抑制作用的影響。結果發(fā)現(xiàn)，對氟蟲腈的敏感性與敏感型受體相比，Y258S和R282Q的影

8、響相對較小;A284S和A284G使靶標對氟蟲腈的敏感性下降到了另一個新的水平;而R282Q/A284S氨基酸替換使得靶標對氟蟲腈的敏感性大大降低，這不僅說明A284氨基酸突變在褐飛虱對氟蟲腈的抗性中起重要的作用，而且預示著，田間種群的靶標變異可能不僅僅來自于單個氨基酸替換，可能是多個氨基酸替換的共同效果。
　　因此，本研究對氟蟲腈抗性的分子機制的理解具有重要意義，進一步明確田間種群主效靶標變異后，可以應用于褐飛虱對氟蟲腈及其類似