畢業(yè)論文內(nèi)容要求模板丹參的研究

1、<p><b>　　摘 要</b></p><p>　　丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge），為唇形科鼠尾草屬多年生直立草本植物，其根和根莖皆可入藥，具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩等功效。近年來隨著丹參需求的日益擴(kuò)大，野生資源的逐漸減少，人工種植品種退化及病蟲災(zāi)害等一系列問題的產(chǎn)生，導(dǎo)致丹參產(chǎn)量和質(zhì)量的逐年降低。因此，有效提高丹參中活性成分的含量、培育優(yōu)質(zhì)新

2、品種已成為丹參現(xiàn)代化開發(fā)利用的必由之路。丹參中主要次生代謝產(chǎn)物分為兩大類：一類為水溶性的酚酸類化合物；另一類為脂溶性的丹參酮類物質(zhì)?；趥鹘y(tǒng)中藥多以水煎服的用藥方式，水溶性的酚酸類成分被認(rèn)為是丹參發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)。研究報(bào)道丹參中主要的酚酸類活性成分生物主要源于酪氨酸代謝途徑和苯丙烷類代謝途徑，多為咖啡酸的衍生物，并且其合成受到一些MYB和BHLH類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。鑒于此，本論文在已有研究的基礎(chǔ)上，選取丹參------基因?yàn)檠芯繉?duì)象，克

3、隆其啟動(dòng)子序列并進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析，探究其潛在的表達(dá)調(diào)控模式，為更好地研究丹參------基因的功能及在丹參酚酸類合成中的作用奠定基礎(chǔ)。</p><p>　　1.利用PCR的方法從丹參gDNA水平克隆得到了--------基因的啟動(dòng)子序列，該序列全長(zhǎng)---------bp。</p><p>　　2.利用啟動(dòng)子在線分析軟件進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析。分析結(jié)果顯示，該基因啟動(dòng)子區(qū)域上分布

4、有與生物或非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件如-----、-----、-----等，以及與激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件------、-------等。</p><p>　　關(guān)鍵詞：丹參，-----基因,啟動(dòng)子，順式作用元件。</p><p><b>　　Abstract</b></p><p><b>　　第1章 引言</b>&

5、lt;/p><p>　　1.1丹參的研究概況</p><p>　　丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge），又名赤參、逐烏、郁蟬草、奔馬草等，為唇形科鼠尾草屬多年生直立草本植物，產(chǎn)河北，山西，陜西，山東，河南，浙江，江蘇，安徽，江西及湖南等地，生于海拔120～1300米的山坡、林下草叢或溪谷旁[1]。根和根莖可入藥，味苦，微寒。歸心，肝經(jīng)。具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩的功

6、效。在臨床上廣泛用于用于月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，胸腹刺痛，熱痹疼痛，瘡瘍腫痛，心煩不眠，肝脾腫大，心絞痛等癥的治療[2]。</p><p>　　丹參具有種植條件簡(jiǎn)單、繁殖周期短、即能雜交授粉又能自交授粉[3]、次生代謝產(chǎn)物豐富，主要化學(xué)成分明晰[4,5,6]，基因組相對(duì)小[7]、基因操作技術(shù)成熟簡(jiǎn)便[8-10]等優(yōu)點(diǎn)。是研究藥用植物次生代謝產(chǎn)物生物合成及調(diào)控的理想材料。因此具有“藥用模式植物”之稱[11-13]。&l

7、t;/p><p>　　丹參為我國十大大宗藥材之首，年需求量超萬噸，僅原藥材生產(chǎn)銷售額達(dá)數(shù)億元人民幣，現(xiàn)已上市的中成藥和復(fù)方制劑達(dá)百余種，總產(chǎn)值超過100億元[11]。</p><p>　　1.1.1 丹參主要化學(xué)成分及其藥理作用</p><p>　　對(duì)丹參活性成分的研究始于二十世紀(jì)三十年代。依據(jù)已分離化合物的特特夠特征和理化性質(zhì)，將其分為兩類：脂溶性丹參酮類化合物與

8、水溶性酚酸類化合物[4,5,6]。（見圖1-1）。自1934開始，現(xiàn)已分離鑒定的丹參脂溶性化合物達(dá)40余種，主要包括丹參酮I、IIA、IIB 、V 、VI，異丹參酮I、II 、IIB，隱丹參酮，異隱丹參酮，丹參新醌A、B、C 、D，二氫異丹參酮、丹參酮二酚、丹參環(huán)庚三烯酚酮等[14]。其中，丹參酮ⅡA 是丹參治療冠心病的主要成分之一，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、、抗血小板凝集、清除氧自由基、改善記憶力障礙等作用，被2010年版《中華人民共和國藥典

9、》規(guī)定為丹參藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)成分之一；隱丹參酮具有強(qiáng)抗菌性，而且對(duì)治療心肌缺血也有一定的療效并對(duì)治療心肌缺血也有一定的療效，是丹參抗菌消炎類制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)[2,15-17]。對(duì)丹參水溶性成分的相關(guān)研究始于20世紀(jì)70年代，至今已分離鑒定了咖啡酸、迷迭香酸，迷迭香酸甲酯，丹酚酸A、B、C 、D、E、F 、G， 原兒茶醛，原兒茶酸，紫草酸，丹參素，異阿魏酸，紫草酸單甲酯，紫草酸二甲酯， 紫草酸乙酯等20多種水溶性的酚酸類物質(zhì)[4,18

10、-</p><p>　　除以上所述化合物，丹參中還含有微量的鼠尾草酚、彌羅松酚、黃芩苷、熊果酸、柳杉酚、琥珀酸和β-谷甾醇-D-葡萄糖苷等化學(xué)成分。</p><p>　　圖1-1 丹參酚酸類化合物的結(jié)構(gòu)</p><p>　　Figure 1-1 Structures of the phenolic acids of S. miltiorrhiza</p>

11、<p>　　1.1.2 丹參資源利用的現(xiàn)狀</p><p>　　隨著對(duì)丹參有效成分及藥理作用的深入研究，近年來以丹參為主要原材料的產(chǎn)品不斷被推出，丹參的需求量越來越多。伴隨著丹參需求量的日益增加，對(duì)丹參野生資源的采挖力度加大，同時(shí)人工種植面積也在不斷增加。但是，丹參作為異交植物，其種內(nèi)變異非常大，性狀也很復(fù)雜。因此只注重?cái)U(kuò)大栽培面積而忽略其優(yōu)良品種選育導(dǎo)致了丹參品種嚴(yán)重退化，質(zhì)量不均一，有效成分含量

12、降低等諸多問題，從而影響了丹參作為高品質(zhì)藥用植物大規(guī)模進(jìn)軍國際市場(chǎng)[24-25]。另外，人工栽培條件下藥田生態(tài)環(huán)境中生物多樣性差、豐富度低，導(dǎo)致丹參病蟲害優(yōu)勢(shì)種群突出、病蟲害頻發(fā)等問題也嚴(yán)重影響了藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量[26,27]。因此為了提高丹參品質(zhì)，更好的滿足其市場(chǎng)需求，近年來利用基因工程、細(xì)胞工程等現(xiàn)代生物技術(shù)手段對(duì)丹參進(jìn)行改良來篩選優(yōu)異丹參資源細(xì)胞工程等現(xiàn)代生物技術(shù)手段對(duì)丹參進(jìn)行改良，篩選優(yōu)異丹參資源，提高丹參藥材有效成分的含量愈來

13、愈受到人們的重視。</p><p>　　1.2丹參酚酸類物質(zhì)的合成</p><p>　　1. 2.1 丹參酚酸類成分生物合成途徑的研究概況 </p><p>　　迷迭香酸在多種唇形科植物中均有發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸生物合成相關(guān)酶基因已經(jīng)研究的較為清楚?？Х人岷偷⑺氐葞追N單苯環(huán)物質(zhì)可由氨基酸直接氧化脫氨生成，而其余均可視為咖啡酸與丹參素酯化縮合反應(yīng)得到產(chǎn)物。丹參素源于酪氨

14、酸代謝途徑，咖啡酸來自苯丙烷類代謝途徑，迷迭香酸是由酪氨酸代謝途徑和苯丙烷類代謝途徑共同參合成的。酪氨酸代謝途徑中的羥基苯丙酮酸還原酶（HPPR）與酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（TAT）參與了丹參素的合成；迷迭香酸合酶（RAS）、苯丙烷類代謝途徑中的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）和4-香豆素輔酶A連接酶（4CL）以及酪氨酸代謝途徑中的TAT和HPPR共同參與了迷迭香酸及丹酚酸B的生物合成過程[28-29]。丹參酚酸類化合物的

15、生物合成途徑分為三部分。第一部分：莽草酸途徑，由葡萄糖經(jīng)過多步酶促反應(yīng)生成莽草酸，進(jìn)而形成芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸，它們是連接初生代謝和次生代謝的關(guān)鍵。第二部分：酪氨酸代謝和苯丙烷主干代謝兩條互相平行的途徑，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL）催化作用下生成肉桂酸，肉桂酸在細(xì)胞色素P450單加氧酶CYP73 亞家族的肉桂酸- 4- 羥化酶(C4H）和4</p><p>　　1.2.2丹參酚酸類物質(zhì)的調(diào)控研究&l

16、t;/p><p>　　目前對(duì)于丹參酚酸類活性成分生物合成的骨架途徑已研究的較為清楚。丹參酚酸類活性成分生物合成主體途徑上的多數(shù)酶基因已被克隆，這些酶基因的表達(dá)及調(diào)控與酚酸類化合物的累積密切相關(guān)。丹參中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆素輔酶A連接酶（4CL）、酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（TAT）、羥苯基丙酮酸還原酶（HPPR）以及迷迭香酸合酶（RAS）共同參與了酚酸類化合物主要成分-丹酚酸B的生物

17、合成過程[30]。</p><p>　　1.3 各自基因的介紹</p><p>　　1.3.1 -------基因概述</p><p><b>　　重點(diǎn)闡述！</b></p><p>　　1.3.2 -------基因啟動(dòng)子的研究進(jìn)展</p><p><b>　　重點(diǎn)闡述！</b&

18、gt;</p><p>　　1.3.2 -------基因的表達(dá)調(diào)控</p><p><b>　　重點(diǎn)闡述！</b></p><p>　　1.4 本研究的目的意義 </p><p><b>　　---</b></p><p>　　第2章 丹參-----基因啟動(dòng)子序列的克隆&l

19、t;/p><p>　　2.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑及主要實(shí)驗(yàn)儀器</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)所用植物材料</p><p>　　丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）種子從購自陜西道地藥材有限公司，種于蛭石與營養(yǎng)土(體積比約為3：1)混合的培養(yǎng)土的盛有蛭石的培養(yǎng)盆中于人工氣候箱中培養(yǎng)，每隔兩天澆一次水。當(dāng)幼苗長(zhǎng)出第二對(duì)真葉時(shí)栽至含蛭石的營養(yǎng)缽中，每個(gè)

20、營養(yǎng)缽種 3 棵幼苗。人工氣候箱培養(yǎng)條件：光周期16/8 h（day/night），光照強(qiáng)度2000 lx 216 µmol·m2·s-1，溫度 25 2 ℃，濕度60 ~ 80 %。本章實(shí)驗(yàn)材料為人工氣候箱中培養(yǎng)30 d后的丹參實(shí)生苗。將丹參種子種在蛭石與營養(yǎng)土(體積比約為3：1)混合的培養(yǎng)土中，幼苗在第二對(duì)真葉長(zhǎng)出時(shí)移至營養(yǎng)缽中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度25 2 °C，濕度60 ~ 80 %，光

21、周期16/ 8 h（day/night），光照強(qiáng)度2000 lx。</p><p><b>　　2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑</b></p><p>　　LA EX Taq® Polymerase、dNTP mix,T4 DNA Ligase,PrimeScript® RT reagent Kit EmeraldAmp® PCR Master Mi

22、x, DL 2000 DNA Marker, pMD®19-T Simple Vector（購自TaKaRa公司）；</p><p>　　BD Genome Walker? Universal Kit（購自Clontech公司）；</p><p>　　DNA膠回收試劑盒（AXYGEN公司）；</p><p>　　氨芐青霉素鈉（Ampicillin sodi

23、um，Amp）Amresco公司</p><p>　　引物序列合成，克隆片段測(cè)序均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成；</p><p>　　其它常規(guī)試劑采用進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。</p><p>　　附：實(shí)驗(yàn)所用緩沖液和培養(yǎng)基配方，及本章實(shí)驗(yàn)中所用到但未列出的各種試劑配制方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[104]。</p><p>　?。?）實(shí)驗(yàn)

24、所用抗生素及植物激素的配制：</p><p>　　Amp儲(chǔ)備液（100 mg/mL）：無菌水溶解10.0 g氨芐青霉素鈉，定容至100 mL，0.22 μm無菌濾頭過濾除菌，1 mL分裝置于-20℃ 貯存。以100 μg/mL的使用終濃度添加于LB培養(yǎng)基；</p><p>　　（2） CTAB提取液(1L)</p><p>　　CTAB 10.0g； &

25、lt;/p><p>　　PVP 25.0g；</p><p>　　NaCl 40.908g；</p><p>　　EDTA 3.7224g；</p><p>　　Tris: 6.057g；調(diào)PH8.0。</p><p>　?。?） TAE緩沖液（50×）（使用的時(shí)侯稀釋至1×

26、;）：</p><p>　　Tris 242.0 g；</p><p>　　EDTA 18.612g；</p><p>　　冰乙酸 57.1 mL；</p><p>　　加H2O定容至1000 mL，室溫保存。</p><p>　?。?） LB (Luria-Bertani) 培養(yǎng)基（1 L）：

27、</p><p>　　NaCl 10.0g；</p><p>　　Tryptone 10.0g；</p><p>　　Yeast extract 5.0g，調(diào)pH7.0；固體LB培養(yǎng)基再附加15.0g瓊脂粉。</p><p><b>　　2.1.3實(shí)驗(yàn)儀器</b></p><p&g

28、t;　　恒溫培養(yǎng)箱 上海智新苗實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司</p><p>　　紫外-可見分光光度計(jì) UNICAM UV-300</p><p>　　HH-6B數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司</p><p>　　搖床 上海智誠實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司</p><p>

29、;　　電泳儀 北京六一儀器廠DY-8型</p><p>　　超凈工作臺(tái) AIR TECH 蘇州凈化設(shè)備有限公司</p><p>　　玻璃儀器氣流烘干機(jī) 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司</p><p>　　渦旋器 姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司 XH-B<

30、;/p><p>　　PCR儀 美國BIO-RAD公司 </p><p>　　NanoDrop 2000核酸儀 美國Thermo Scientific公司</p><p>　　凝膠成像系統(tǒng) 美國Media Cybernetics公司 UVP GDS-8000型</p><p&g

31、t;　　超純水儀 美國Millipore公司</p><p>　　超低溫-80℃冰箱 美國Thermo Fisher Scientific公司</p><p>　　冷凍臺(tái)式離心機(jī) 德國Eppendorf公司Centrifuge 5802R</p><p>　　Eppendorf微量移液器

32、 德國Eppendorf公司</p><p>　　電子天平 德國Sartorius公司</p><p>　　4℃/-20℃冰箱 德國SIEMENS公司</p><p>　　高壓滅菌鍋 日本SANY公司MLS-3750型</p><p

33、><b>　　2.2實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 丹參基因組DNA的提取</p><p>　　丹參基因組DNA的提取采用CTAB法。</p><p>　?。?）將CTAB在水浴鍋中預(yù)熱至65℃，研缽、研磨棒在液氮中預(yù)冷。</p><p>　?。?）取新鮮的丹參葉片于研缽中，加入液氮迅速研磨使其成

34、粉末。</p><p>　?。?）稱取0.2～0.3g研磨樣于EP管中，每管中分別加入CTAB600μL,和Lβ-巰基乙醇12μ，顛倒混勻數(shù)次。</p><p>　?。?）65℃水浴約60min，這一過程中每10 min顛倒混勻一次；</p><p>　　（5）每管加入4μL的RNA酶，37℃水浴約30min；</p><p>　?。?）5,

35、500 rpm離心15 min，取上清；</p><p>　?。?）加入氯仿/異戊醇（24:1）480μL，20μL抽提一次。；</p><p>　?。?）12,000 rpm離心5 min，取上清；</p><p>　?。?）重復(fù)步驟7、8兩次；</p><p>　?。?0）加樣品二倍體積的無水乙醇，1/10提及的NaOAC；</p&

36、gt;<p>　?。?1）-20℃放置1h以上，用槍頭將DNA挑至EP管中。；</p><p>　　（12）加750μL的無水乙醇和250μL Elution Buffer，12,000 rpm離心5 min，洗脫兩次，去上清，干燥；</p><p>　?。?3）加0.1～0.5mL Elution Buffer，65℃水浴，使DNA完全溶解。</p><

37、p>　　------基因啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增</p><p>　　在NCBI查到注冊(cè)號(hào)為GU218694.1的-----基因，根據(jù)其序列特征，利用PrimierPrimier5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，ORF采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的引物，引物序列見表2-1分別以丹參cDNA和gDNA為模板，分別擴(kuò)增SmPAP1基因的ORF和DNA全長(zhǎng)，擴(kuò)增體系（50 μL）如下：</p&

38、gt;<p>　　Template DNA 1μL</p><p>　　Primer F (10 μM) 0.5μL</p><p>　　Primer R (10 μM)

39、 0.5μL</p><p>　　2×Taq MasterMix 10μL</p><p>　　dd H2O add to 20μL

40、 </p><p><b>　　擴(kuò)增條件：</b></p><p>　　94 ℃，10 min；</p><p>　?。?4 ℃，30 s；57 ℃，1min；72 ℃，50 s）33Cycles</p><p>　　72 ℃，10 min</p><p>　　PCR擴(kuò)增產(chǎn)

41、物經(jīng)膠回收分別與pMD®19-T Simple Vector連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)的陽性克隆送至上海桑尼生物有限公司測(cè)序。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化方法（熱激轉(zhuǎn)化法）參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[104]</p><p>　　PCR產(chǎn)物純化及克隆的方法與步驟：</p><p>　　（1）PCR產(chǎn)物凝膠回收及純化采用

42、DNA Gel Extraction KitⅡ (U-gene, Hefei)進(jìn)行：</p><p>　?、儆檬中g(shù)刀片在紫外燈下切含有目的 DNA條帶的瓊脂糖凝膠塊，用濾紙吸干凝膠表面殘余液體，切碎。</p><p>　　②加入400μL的 Buffer DE-A，混合均勻后于 75℃ 水浴加熱約7min，至凝膠塊完全熔化，其間每3min左右輕輕震蕩混勻反應(yīng)管。</p>&l

43、t;p>　?、奂?00μL Buffer DE-A 并混合。（分離的DNA片段長(zhǎng)度<1000bp 時(shí)，另外加入100 μL異丙醇。） 混合物顏色變?yōu)辄S色后，充分混勻保證形成均一顏色。</p><p>　?、芪∩鲜龌旌弦?，移至DNA制備管（置于2 mL ，嵌套在試劑盒附帶的2mL離心管中，離心（12,000×g 1 min）。棄濾液。⑤將制備管放回 2 mL 離心管中，加 500μL Buf

44、fer W1 ，12,000×g 離心 30 s ，棄濾液。</p><p>　?、迣⒅苽涔苤没?2 mL 離心管，加入700 μL Buffer W2 ，12,000×g 離心 30 s ，棄濾液。</p><p><b>　?、咧貜?fù)步驟6一次。</b></p><p>　?、鄬⒅苽涔苤没?2 mL 離心管中，12,000

45、×g 離心2 min。</p><p>　　⑨將制備管放于試劑盒所帶的 1.5 mL EP管中，在膜中央加28 μL提前已加熱至65℃的Eluent。室溫靜置1 min。12,000×g 離心1 min 洗脫。</p><p>　　⑩重復(fù)步驟9一次，其中的室溫靜置時(shí)間延長(zhǎng)到3min。</p><p>　?。?）連接體系（10 μL）： </

46、p><p>　　膠回收片段 5 μL</p><p>　　pMD®1 9 -T Simple Vector*1 0.5 μL </p><p>　　Solution1

47、 4.5μL</p><p>　　連接條件： 4℃過夜。</p><p>　?。?）大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化</p><p>　?、?感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl2法）[104]</p><p>　　加5 mL LB液體培養(yǎng)基于無菌的50 mL離心管中，用滅過菌的牙簽從平板上挑取生長(zhǎng)良好的DH5α單菌落接種于該離心管中，37℃

48、恒溫180 rpm培養(yǎng)過夜。次日取2 mL過夜培養(yǎng)物接種到含100 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃恒溫180 rpm快速培養(yǎng)至OD600為0.3～0.4。</p><p>　　無菌條件下將菌液轉(zhuǎn)移至兩只經(jīng)高壓滅菌的50 mL離心管中，立即冰浴30 min。4℃，5,000 rpm離心8 min收集細(xì)胞；棄上清，將管倒置使殘留培養(yǎng)液流盡；加10 mL預(yù)冷的0.1 M CaCl2溶液溫和重懸菌體，冰浴20 m

49、in；4℃，5,000 rpm離心7 min，棄上清，沉淀用5 mL甘油（75%甘油用0.1 M CaCl2稀釋至濃度為15%）懸浮，100 µl分裝。液氮速凍，-80℃保存。 </p><p><b>　?、?轉(zhuǎn)化（熱激法）</b></p><p>　　凍存于-80℃的感受態(tài)細(xì)胞置冰上溶化，將連接產(chǎn)物加入溶化后的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴 40 min，42℃熱激

50、 85 s，不要搖動(dòng)試管，立即冰浴靜置2 min。加入400 µl LB液體培養(yǎng)基，37℃ 100 rpm恢復(fù)培養(yǎng)1 h后，將菌液均勻涂布于含有氨芐青霉素（100 mg l-1）的LB固體培養(yǎng)基上。于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)10～14 h。</p><p>　?。?）菌落PCR檢測(cè)</p><p>　　挑取單克隆至10 mLLB液體培養(yǎng)基（含100 mg/L氨芐青霉素），37

51、℃ 150 rpm </p><p>　　下振蕩培養(yǎng)過夜。待菌液渾濁后進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。20 μl）</p><p><b>　　反應(yīng)體系如下：</b></p><p>　　菌液 2 μL</p><p>　　Primer

52、F (10 μM) 0.5 μL </p><p>　　Primer R (10 μM) 0.5μL</p><p>　　2×Taq MasterMix 10μL&l

53、t;/p><p>　　dd H2O add to 20μL</p><p><b>　　擴(kuò)增條件為</b></p><p>　　94℃，10 min；</p><p>　?。?4℃，30 s；57℃，1min；72℃，50 s）33Cyc

54、les</p><p>　　72℃，10 min</p><p><b>　　（5）菌株的保存：</b></p><p>　　將活化好的菌液于10,000 rpm離心3 min，收集菌體，保存于終濃度為15％的甘油中，-20℃存放。</p><p><b>　　-</b></p>&l

55、t;p>　　PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，切去其中>1000bp的片段進(jìn)行膠回收，純化產(chǎn)物克隆連接到pMD®19-T Simple Vector，送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。</p><p>　　------基因啟動(dòng)子的5’側(cè)翼序列的序列分析</p><p>　　分析PCR產(chǎn)物序列的結(jié)果，我們得到了一條長(zhǎng)-----bp的5’側(cè)翼序列，其A+T

56、含量符合啟動(dòng)子區(qū)高A+T含量的特征。利用PlantCARE database分析表明，在------基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游總共有38個(gè)可能的TATA box。我們認(rèn)為，------基因最可能的TATA box 位于-65~-57 bases處，其序列為：TCTATATATA。在SmPAP1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游共找到11個(gè)可能的CAAT box序列，這些序列被認(rèn)為對(duì)轉(zhuǎn)錄效率具有非常重要的作用。</p><p>　　

57、分析結(jié)果顯示，在-----基因的啟動(dòng)子區(qū)，分布著多種類型的順式作用元件，分別是與生物源或非生物源脅迫相關(guān)的順式作用元件(表3-1)</p><p>　　表3-1 預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件</p><p>　　Tabel 3-1 Cis-acting element analysis of promote sequences</p><p>　　2.3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分

58、析</p><p>　　1）：基因組DNA的提取質(zhì)量檢測(cè)</p><p>　　2）-----基因啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增</p><p>　　3）-----基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析</p><p>　　圖 2-1 丹參SmPAP1 基因PCR電泳圖</p><p>　　M：DL2,000 Marker；B：空白對(duì)照; 1

59、：以DNA為模板擴(kuò)增；;2:以cDNA為模板擴(kuò)增；</p><p>　　Fig. 2-1 The PCR amplification of SmPAP1 gene from S. miltiorrhiza.</p><p>　　M,DL2,000 Marker;B,no template control; 1,PCR amplification from gDNA2, PCR amplif