靈菌紅素染色性能及染色后抗菌穩(wěn)定性研究[畢業(yè)設(shè)計(jì)]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</p><p><b>　　（二零 屆）</b></p><p>　　靈菌紅素染色性能及染色后抗菌穩(wěn)定性研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí) 生物工程

2、</p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱(chēng) </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要：靈菌紅素(prodigiosins，PG)是具有多種生物活性的微生

3、物次級(jí)代謝產(chǎn)物，在醫(yī)學(xué)、環(huán)境治理、食品、紡織等方面均有重要作用。本實(shí)驗(yàn)先用平板抑菌圈法，對(duì)靈菌紅素的抗菌活性進(jìn)行初步定性探討。結(jié)果表明靈菌紅素對(duì)四種供試菌皆表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最明顯，金黃色葡萄球菌次之，對(duì)大腸桿茵抑制效果較弱，在一定程度上對(duì)銅綠假單胞菌有抑制作用。其次選擇真絲作為試樣，研究了溫度、溶劑比、pH值等因素對(duì)靈菌紅素上染率的影響，確定簡(jiǎn)單的染色工藝條件：溶劑比例，丙酮:水 1：2；染色溫度7

4、0℃；染色pH 6~7；染色時(shí)間1h；在此基礎(chǔ)上選擇金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為試驗(yàn)菌種，通過(guò)平板抑菌圈法和搖瓶震蕩法進(jìn)一步研究染色后織物的抑菌活性。結(jié)果表明：染色后的織物仍具有抗菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率為98%，抑制作用強(qiáng)于大腸桿菌47%。本次實(shí)驗(yàn)為靈菌紅素在抗菌織物方面的價(jià)值評(píng)價(jià)及開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：靈菌紅素；抑菌性能；真絲；染色工藝條件；天然抗菌材料</p>

5、<p>　　Abstract: Prodigiosin is a kind of variety active biologically secondary metabolites, which played an important role in medicine, environmental management, food, textiles, etc. In this study, with the plate

6、inhibition zone method, we analyzed the preliminary antimicrobial activity qualitative of prodigiosin firstly. The results showed that the prodigiosin showed different degrees of inhibition in four strains, the ability o

7、f inhibition was B.subtilis> S.aureus> P.aeruginosa> E.coli. Secondly, w</p><p>　　Keywords: Prodigiosin; antibacterial properties; silk; dyeing conditions; natural antimicrobial materials</p>

8、<p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　摘要I</b></p><p>　　Abstract.II</p><p><b>　　1 緒論1</b></p><p>　　1.1 靈菌紅素的基本性質(zhì)1</p>&l

9、t;p>　　1.2 選題背景及意義2</p><p>　　2 方法與材料4</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料4</p><p>　　2.1.1 菌種4</p><p>　　2.1.2 主要儀器與試劑4</p><p>　　2.1.3 培養(yǎng)基及溶劑配方4</p><p

10、>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法5</p><p>　　2.2.1 靈菌紅素的制備5</p><p>　　2.2.2 靈菌紅素的抗菌性能測(cè)試6</p><p>　　2.2.3 靈菌紅素染色性能研究6</p><p>　　2.2.4 經(jīng)染色整理后的織物其抗菌性能研究7</p><p>　　3 結(jié)果與分析

11、8</p><p>　　3.1 靈菌紅素對(duì)不同微生物抑菌性能的研究8</p><p>　　3.2 靈菌紅素染色性能研究9</p><p>　　3.2.1 染色時(shí)丙酮與水的比例對(duì)上染率的影響9</p><p>　　3.2.2 染色溫度對(duì)上染率的影響10</p><p>　　3.2.3 染液pH對(duì)上染率

12、的影響12</p><p>　　3.3 經(jīng)染色整理后的織物其抗菌性能研究13</p><p>　　3.3.1 平板抑菌圈法定性測(cè)染色后織物的抗菌性能13</p><p>　　3.3.2 瓶振蕩法定量測(cè)染色后織物的抗菌性能14</p><p><b>　　4 結(jié)論16</b></p><

13、;p><b>　　致 謝16</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)18</b></p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1 靈菌紅素的基本性質(zhì)</p><p>　　靈菌紅素(prodigiosins，PG)是一類(lèi)天然紅色素的總

14、稱(chēng)，呈暗紅色，具有綠色反光，熔點(diǎn)151~152℃[1]。是由一些放線(xiàn)菌、沙雷氏菌及其它細(xì)菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗瘧疾、抗原生動(dòng)物、抗腫瘤等免疫抑制活性，通常都有3個(gè)吡咯環(huán)組成的甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)，1929年由Amak等研究Serratia生長(zhǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，包括prodigiosin，prodigiosin 25-C，metacycloprodigiosin(MP) desmethoxyprodigiosin 和uncedy

15、lprodigiosin(UP)等。[2,3] 其結(jié)構(gòu)式如下：</p><p>　　PG屬于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，幾乎不溶于水，在極性較強(qiáng)的酸性和堿性水溶液中微溶，在極性較弱的有機(jī)溶劑如乙醚或石油醚中微溶或不溶。在堿性或中性溶液中呈橙黃色，在酸性溶液中呈紅色。以乙醇為溶劑，酸性條件下靈菌紅素在535nm處有特征吸收；堿性條件下在466nm處有特征吸收[4]。PG對(duì)溫度穩(wěn)定，但受pH的影響較大，酸性環(huán)境中能

16、保持較長(zhǎng)的時(shí)間，堿性條件下則損失較大；A13+，Ca2+，K+，Ba2+等金屬離子對(duì)PG的穩(wěn)定性影響不大，Zn2+有使PG增色的作用，Mg2+和Mn2+對(duì)PG有一定的破壞作用，Pb2+可以絡(luò)合PG，使之成為沉淀[5]。白光和藍(lán)光使PG發(fā)生光解，在紅光和遠(yuǎn)紅光下PG則不會(huì)降解[6]。</p><p>　　在醫(yī)學(xué)上，PG日漸成為醫(yī)學(xué)專(zhuān)家的研究對(duì)象。Cang等[7]以沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)的PG做抗菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，其對(duì)芽孢

17、桿菌具有顯著地殺菌作用。PG的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物具有顯著的抗Trichopyton spp.等真菌的活性[8]，在臨床測(cè)試中表現(xiàn)出對(duì)Coccidmycosis引起的一種地方性真菌傳染病有良好的治愈作用。Isaka等[9]從Streptomyces spectabilis BCC 4785的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的MP有顯著的抗瘧疾活性。但由于可獲得的PG量有限，對(duì)其進(jìn)一步作用的研究很少。</p><p>　　PG不僅擁有抗菌

18、和抗瘧疾等方面的活性，最近研究表明PG有很強(qiáng)的抗腫瘤及免疫抑制活性，在平均IC50為2.1 μmol·L-1時(shí)對(duì)57種不同的人癌細(xì)胞有抗性作用[10]，如肺，結(jié)腸，腎和乳房的癌細(xì)胞系等。比起化學(xué)療法藥劑，如環(huán)磷琉胺（cyclophosphamide），PG具有低細(xì)胞毒作用，只有當(dāng)濃度大于300nM時(shí)才具有明顯的淋巴細(xì)胞抑制作用。而后者在其有效濃度時(shí)毒性已非常高[3,4]。臨床上將PG與CyA結(jié)合用于解除器官移植急性排斥反應(yīng)，作

19、用效果好[7]。對(duì)其潛伏期和臨床應(yīng)用有待進(jìn)一步的研究。雖然Melvin[11]，Montaner[12]，Songia[13]，Yamamoto[14]，,avila[15]等人對(duì)prodigiosins抗腫瘤機(jī)制尚有爭(zhēng)議，但其抗腫瘤的生物活性已被眾人認(rèn)可,這為治療一些類(lèi)似于癌癥這樣的不治之癥提供了一些新的研究方向。</p><p>　　PG做為一種生物發(fā)酵產(chǎn)生的染料，穩(wěn)定性高、專(zhuān)一性強(qiáng)、無(wú)污染，生產(chǎn)過(guò)程對(duì)人無(wú)害

20、，是一種很好的染料合成的方法。[4]</p><p>　　此外，PG具有強(qiáng)烈的細(xì)胞溶解酶活性，能殺滅引起赤潮的浮游藻類(lèi)[16]。韓國(guó)科學(xué)家于1996年首次在海洋中發(fā)現(xiàn)，并將位于朝鮮半島以南的美羅島海域被命名為“哈赫拉·下濟(jì)州”的一種微生物，進(jìn)行了基因組測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)，這種微生物能產(chǎn)生可以清除赤潮的靈菌紅素。將靈菌紅素撒在赤潮中，只需十億分之一的濃度，一小時(shí)后就能將導(dǎo)致赤潮的浮游生物大部分殺死。目前，韓國(guó)

21、科學(xué)家已經(jīng)為靈菌紅素申請(qǐng)了韓國(guó)和國(guó)際專(zhuān)利。靈菌紅素有望經(jīng)過(guò)毒性試驗(yàn)和環(huán)境影響檢測(cè)，在3年后作為治理赤潮的產(chǎn)品投入應(yīng)用[17]。</p><p>　　20世紀(jì)60年代早期，Rapoport等首先描述了PG化學(xué)合成的全過(guò)程，但比較復(fù)雜和困難。1996年D’Alessio 等[18]提出了新的制備PG類(lèi)似物的方案，先將C環(huán)和B環(huán)相連然后再和A環(huán)結(jié)合（以往模擬生物合成路線(xiàn)是先將B環(huán)和A環(huán)相連）即得PG前體物質(zhì)，步驟簡(jiǎn)單，

22、合成效率明顯提高，但不能用來(lái)合成天然的十二烷基PG。利用化學(xué)合成法大量制備PG一直未能實(shí)施，人們寄希望于微生物發(fā)酵生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)外對(duì)產(chǎn)PG微生物的研究主要集中在陸地微生物沙雷菌上。主要通過(guò)誘變方式希冀得到高產(chǎn)菌株。20世紀(jì)80年代以來(lái)，人們開(kāi)始從基因水平研究PG的生物合成途徑及其調(diào)節(jié)，隨著生物操作技術(shù)的發(fā)展和對(duì)PG的深入研究，人們將更加清晰地認(rèn)識(shí)PG的產(chǎn)生和作用機(jī)制，大量生產(chǎn)制備PG，用于替代對(duì)人體有害作用的化學(xué)藥物，造福于人類(lèi)[2]。

23、 PG在醫(yī)藥、食品、印染、飼料添加劑、環(huán)境治理等領(lǐng)域，均具有巨大的應(yīng)用潛力和廣闊的市場(chǎng)前景。</p><p>　　1.2 選題的背景及意義</p><p>　　近年來(lái)，由于環(huán)境和能源等問(wèn)題，人們趨于追求健康可持續(xù)的方法制取染料。開(kāi)發(fā)天然色素染料是世界應(yīng)用染料發(fā)展的總趨勢(shì)。天然色素是指從植物、動(dòng)物或礦產(chǎn)資源中獲得的、很少或沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)加工的染料，很多天然色素具有安全可靠、色調(diào)自然、接近

24、天然物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)；而且使用天然色素染色在我國(guó)具有悠久的歷史，明清時(shí)期，我國(guó)天然染料的制備和染色技術(shù)都已達(dá)到很高的水平。[19] 天然染料多來(lái)源于動(dòng)植物，這使得它難以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。以植物染料為例，即使是同一種植物，由于產(chǎn)地不同、氣候條件不同及采集時(shí)間不同都會(huì)影響色素的組成及色澤。而這必然會(huì)導(dǎo)致染料的染色重復(fù)性差。[20] 再者，由于動(dòng)植物中色素含量較小，要想獲得足夠染料，就要大量采摘或砍伐植物，或者獵取動(dòng)物。這會(huì)造成對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞，違背

25、了使用天然染料染色以利于生態(tài)和環(huán)保的初衷。另外，許多天然染料也都是中草藥資源，具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如果將它們大量用于染料的提取，也是不經(jīng)濟(jì)的。[21] 因此，天然染料制取不易，價(jià)格高昂，且在加工、貯存過(guò)程中容易褪色和變色，其應(yīng)用受到一定的限制，目前無(wú)法用天然染料完全替代合成染料。</p><p>　　合成染料自19世紀(jì)中葉問(wèn)世以來(lái)，由于色澤鮮艷、色譜齊全、性質(zhì)穩(wěn)定，易于調(diào)色，著色力強(qiáng)，成本低廉，使用方

26、便，等特點(diǎn)，逐步取代了天然染料，為色素的使用提供了更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)途徑，成為紡織品最主要的著色劑[19]。但合成染料多為含有R—N=N—R’鍵、苯環(huán)或氧雜葸結(jié)構(gòu)的化臺(tái)物，它們對(duì)人體存在一定的不安全性。近幾年的研究表明，隨著色素安全性試驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)合成色素對(duì)人體有不同程度的毒性作用，有100多種常用染料有可能產(chǎn)生致癌物質(zhì)。1994年德國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家頒布了禁用這些染料的法規(guī)。[19] 不僅如此，隨著地球石油資源的消耗，合成染料的原

27、料問(wèn)題已暴露出來(lái)。</p><p>　　因此，天然、多功能、環(huán)保是染料發(fā)展的必然趨勢(shì)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用生物技術(shù)生產(chǎn)天然染料為人們開(kāi)辟了廣闊的領(lǐng)域。生物發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性高、專(zhuān)一性強(qiáng)、無(wú)污染，生產(chǎn)過(guò)程對(duì)人無(wú)害，是一種很好的染料合成的方法[4]。從自然資源中篩選出可以生產(chǎn)天然染料的微生物，進(jìn)而開(kāi)發(fā)新品種的天然染料，尤其是具有功能性的天然染料[22,23]，具有廣闊的前景。</p><p>

28、　　PG作為由發(fā)酵產(chǎn)生的具有重要生物活性的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一類(lèi)呈暗紅色的天然色素，色澤亮麗誘人，有抗菌活性，有較好的生物可降解性和環(huán)境相容性，是一種多功能染料，在印染、紡織領(lǐng)域，應(yīng)用優(yōu)勢(shì)相當(dāng)明顯，在高檔真絲制品、保健內(nèi)衣、家紡產(chǎn)品、裝飾用品等領(lǐng)域中擁有廣闊的發(fā)展前景，具有巨大的商業(yè)潛力。</p><p>　　由于纖維自身結(jié)構(gòu)與染料親和力的原因，PG染腈綸織物的上染率要比染羊毛織物的上染率高，且耐皂洗牢度和摩

29、擦牢度也要比羊毛織物的好，經(jīng)A13+媒染劑處理后的羊毛織物的各項(xiàng)牢度均有所改善。[4] Cang等[9]以沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)的PG做抗菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，對(duì)芽孢桿菌具有顯著地殺菌作用。鐘綿國(guó)等對(duì)靈菌紅素羊毛、腈綸染色性能進(jìn)行研究，確定其最佳染色工藝。靈菌紅素羊毛織物的最佳染色工藝條件為：染料用量4%（o.w.f），乙醇：水為1：3，浴比1：50，pH值為7.0，染色溫度80℃，染色60min；靈菌紅素腈綸織物的最佳染色工藝條件為：染料用量

30、3%（o.w.f），乙醇：水為1：2，浴比1：40，pH為6.0，95℃條件下染色50min。并通過(guò)抑菌率的測(cè)試證明靈菌紅素具有較好的抗菌性能[4]。</p><p>　　本次實(shí)驗(yàn)在前人基礎(chǔ)上，用丙酮與水的混合溶液作為靈菌紅素染色的溶劑，選擇真絲作為試樣，探究其染色性能。并采用平板抑菌圈法、搖瓶振蕩法定性或定量測(cè)定靈菌紅素對(duì)常見(jiàn)微生物（大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌）的抗菌性能。為靈菌紅素在

31、抗菌織物方面的價(jià)值評(píng)價(jià)及開(kāi)發(fā)利用提供一定依據(jù)，加快靈菌紅素工業(yè)化進(jìn)程。</p><p><b>　　2 方法與材料</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p><b>　　2.1.1 菌種</b></p><p>　　沙雷氏菌( Serr

32、atia jx.1)，本實(shí)驗(yàn)室保藏；</p><p>　　大腸埃希菌（Escherichia coli），本實(shí)驗(yàn)室保藏；</p><p>　　金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus），本實(shí)驗(yàn)室保藏；</p><p>　　枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），本實(shí)驗(yàn)室保藏；</p><p>　　銅綠假單胞菌（P

33、seudomonas aeruginosa），本實(shí)驗(yàn)室保藏。</p><p>　　2.1.2 主要儀器與試劑</p><p>　　QYC-211型全溫空氣搖床（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；</p><p>　　H2050R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；</p><p>　　VS-1300型潔凈工作臺(tái)（蘇州時(shí)速為凈化設(shè)備

34、有限公司）；</p><p>　　PHS-3C型精密pH計(jì)（上海安亨昌吉149號(hào)雷磁儀器廠(chǎng)）；</p><p>　　AL-204型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；</p><p>　　DGX-914381型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；</p><p>　　DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）

35、；</p><p>　　LRH-250A型生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠(chǎng)）；</p><p>　　DSX-280A型不銹鋼手提式滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)）；</p><p><b>　　滅菌鍋；</b></p><p><b>　　旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；</b></p><p>　　7

36、52s紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；</p><p>　　1000μL、200μL移液槍。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所用丙酮、氯化鈉、硫酸鎂、甘油等均為分析純；PN5247蛋白胨、牛肉浸膏等均為生化試劑。</p><p>　　2.1.3 培養(yǎng)基及溶劑配方</p><p>　　種子培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂

37、15，pH 7.4~7.6。</p><p>　　種子擴(kuò)大培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 13.0，甘油 20.0，Nacl 5.0，搖瓶裝液量20mL/250mL（V/V），pH自然，28℃，170r/min，培養(yǎng)24h。</p><p>　　發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨16.0，甘油20.0，MgSO4 1.2，NaCl 2.0，Gly 0.75，pH 5.7，搖瓶裝液量50 mL/250m

38、L(V/V)，接種量5％(V/V)，28℃，170r/min，培養(yǎng)48h。</p><p>　　固體培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，Nacl 5g，瓊脂 15~20g，水1000mL，pH 7.0~7.2。</p><p>　　液體培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，Nacl 5g，水1000mL，pH 7.0~7.2。</p>

39、;<p>　　0.03mol/L PBS（磷酸鹽）緩沖液：磷酸氫二鈉 2.84g，磷酸二氫鉀 1.36g，蒸餾水（最終定容至）1000mL，滅菌后，pH值約為7.2~7.4，5℃~10℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　菌種：沙雷氏菌，大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌。</

40、p><p>　　菌種活化：按照種子培養(yǎng)基的組成稱(chēng)取牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，瓊脂15g，于容器內(nèi)加水至1000mL，加熱攪拌至物料溶解，用1mol/L HCl和1mol/L NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，使其在7.4-7.6[14]。然后分裝在250mL的搖瓶中，用滅菌鍋在121℃下滅菌20min，冷卻至適當(dāng)溫度時(shí)倒平板。待平板冷卻后在無(wú)菌條件下，用接種針挑取甘油冷凍保藏的菌種劃平板，37℃培

41、養(yǎng)18~24h，即得到活化的菌種，將其放于冰箱內(nèi)，4℃左右保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　2.2.1 靈菌紅素的制備</p><p>　　分別稱(chēng)?。╣/L）蛋白胨13.0、甘油20.0、NaCl 5.0放入燒杯中加水，攪拌，使燒杯中的物料完全溶解并分裝于250mL的搖瓶中，每個(gè)搖瓶裝20mL的培養(yǎng)基，并用滅菌鍋在121℃下高溫蒸汽滅菌20min，待搖瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基冷卻后，在無(wú)菌條件下用接種

42、針挑取兩環(huán)平板上的單菌落于搖瓶中。接種完后，28℃，170r/min培養(yǎng)24h，作為種子擴(kuò)大培養(yǎng)。</p><p>　　分別稱(chēng)?。╣/L）蛋白胨16.0、甘油20.0、MgSO4 1.2、NaCl 2.0、Gly 0.75放入容器中加水加熱攪拌，使燒杯中的物料完全溶解并分裝于250mL的搖瓶中，每個(gè)搖瓶裝50mL的培養(yǎng)基，并用滅菌鍋在121℃下高溫蒸汽滅菌20min，待搖瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基冷卻后，在無(wú)菌條件下，從種子擴(kuò)

43、大培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接，接種量為5%（v/v)。接種完后，28℃，170r/min培養(yǎng)48h。</p><p>　　48h后從搖床取出發(fā)酵液，搖勻，分別用量筒量取40mL發(fā)酵液于50mL離心管中，0℃，10000r/min，離心10min，棄上清液，然后用移液管移取20mL的丙酮于各個(gè)離心管中，用玻璃棒攪拌使色素完全溶于丙酮中，再離心，溫度為0℃，10000r/min，離心10min。取出上清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)大部分

44、丙酮，余下置于通風(fēng)櫥內(nèi)自然風(fēng)干，收集色素并于干燥暗處保存，備用。</p><p>　　2.2.2 靈菌紅素的抗菌性能測(cè)試</p><p>　　測(cè)試的菌種包括革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、銅綠假單胞菌）。金黃色葡萄球菌是無(wú)芽胞細(xì)菌中抵抗力最強(qiáng)的致病菌，可作為革蘭氏陽(yáng)性菌的代表；枯草桿菌易形成芽胞，抵抗力強(qiáng)，可作為芽胞菌的代表；大腸桿菌分布相當(dāng)廣泛，通

45、常作為革蘭氏陰性菌的代表性菌種用于各種試驗(yàn)；銅綠假單胞菌在自然界分布廣泛，為土壤中存在的最常見(jiàn)的細(xì)菌之一，各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在，可作為革蘭氏陰性菌的代表性菌。</p><p>　　方法：平板抑菌圈法。</p><p>　　靈菌紅素溶液配制：稱(chēng)取0.002g靈菌紅素溶于5mL的二甲亞砜，制成4g/L的靈菌紅素溶液，90℃滅菌30min后，暗處保存，備用。&l

46、t;/p><p>　　試驗(yàn)菌液的培養(yǎng)和準(zhǔn)備：從3代～10代的細(xì)菌保存菌所在培養(yǎng)基挑取一純種細(xì)菌，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線(xiàn)，于37℃±1℃培養(yǎng)18～24h。用接種針挑取兩環(huán)于5mL無(wú)菌水中，混勻，調(diào)節(jié)各菌濃度至108個(gè)/mL，即制成了菌懸液。</p><p>　　平板抑菌圈法：分別用移液槍取0.2mL各菌懸液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，涂布，每種菌做兩個(gè)平行樣。將靈菌紅素溶液浸泡的無(wú)菌濾紙片貼于該平

47、板，每個(gè)平板分3個(gè)區(qū)域，貼2個(gè)靈菌紅素濾紙片和1個(gè)二甲亞砜對(duì)照濾紙片（如圖3-1~3-4所示）。37℃±1℃倒置培養(yǎng)24h～48h，分別記錄抑菌圈大?。ㄒ?jiàn)表3-1）。</p><p>　　2.2.3 靈菌紅素染色性能研究</p><p><b>　　材料：真絲。</b></p><p>　　內(nèi)容：用靈菌紅素對(duì)上述材料進(jìn)行處理，測(cè)定其

48、上染率，確定其簡(jiǎn)單染色條件。</p><p>　　備注：每染1g織物用靈菌紅素0.04g，溶于100mL有機(jī)溶劑，每次用0.02g織物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　上染率測(cè)試：用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)靈菌紅素最大吸收波段處的吸光度來(lái)計(jì)算上染率。上染率的測(cè)試公式：上染百分率%=（1-Ei/Eo）×100% 。式中Ei—染液殘液吸光度；Eo—標(biāo)準(zhǔn)染液吸光度。</p>

49、<p>　　溶劑比例：以丙酮和水作為靈菌紅素的溶劑，設(shè)定其比例分別為1：1，1：2，1：3，1：4，染色60min，于OD535測(cè)染液吸光度，確定其上染率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3-5。染色時(shí)溶劑比對(duì)上染百分率的影響見(jiàn)表3-2和圖3-6。</p><p>　　不同的染色溫度：選擇合適的溶劑比例后，設(shè)定不同的染色溫度40，55，70，85，100℃，從室溫下開(kāi)始染色，待溫度升到某個(gè)溫度時(shí)開(kāi)始計(jì)數(shù)染色時(shí)間，分別染色6

50、0min，于OD535測(cè)染液吸光度，確定其上染率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3-7。染色時(shí)溶劑比對(duì)上染率的影響見(jiàn)表3-3和圖3-8。</p><p>　　不同染色的pH：選擇合適的溶劑比例、合適的染色溫度后，設(shè)置不同的染色pH分別為3、4、5、6、7、8、9，染色60min，于OD535測(cè)染液吸光度，確定其上染率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3-9。染色時(shí)溶劑比對(duì)上染率的影響見(jiàn)表3-4和圖3-10。</p><p>　

51、　2.2.4 經(jīng)染色整理后的織物其抗菌性能研究</p><p>　　試驗(yàn)菌種：大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌。</p><p>　　內(nèi)容：平板抑菌圈法測(cè)定染色后織物的抑菌圈，搖瓶振蕩法測(cè)定染色后織物的抑菌率。</p><p>　　平板抑菌圈法：取0.2mL各菌懸液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，涂布，每種菌做兩個(gè)平行樣。將染色后的織物和未染色織物均剪成直徑約2cm的圓片90攝氏度滅

52、菌30min后，取出，分別貼于已涂布好菌液的固體培養(yǎng)基中央，未染色的織物作為對(duì)照。37℃±1℃倒置培養(yǎng)24h～48h，分別記錄抑菌圈大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3-11~3-14。經(jīng)過(guò)測(cè)量得出染色后織物對(duì)不同細(xì)菌抑菌圈寬度見(jiàn)表3-5。</p><p>　　搖瓶振蕩法：待測(cè)菌種活化，挑取2環(huán)菌落到9mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基試管，混勻，作為菌懸液待用，稱(chēng)取染色織物和未染色織物各0.75g，剪成0.5cm方塊，用紙包

53、包好，90℃滅菌30min，分別裝入70mL已滅菌的PBS三角燒瓶，200r，37℃培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)液用PBS緩沖液作107稀釋?zhuān)?.2mL 106和107稀釋濃度菌液涂布平板，選取合適的菌落計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)抑菌率。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象見(jiàn)圖3-15~3-18，織物對(duì)E.coli和S.aureus抑菌率的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3-6。</p><p>　　根據(jù)平板得到的菌落數(shù)，按下式計(jì)算每個(gè)試樣燒瓶?jī)?nèi)的活菌濃度：</p>&

54、lt;p><b>　　K=Z×R</b></p><p><b>　　式中：</b></p><p>　　K—每個(gè)試樣燒瓶?jī)?nèi)的活菌濃度（CFU/mL）</p><p>　　Z—平板菌落數(shù)的平均值</p><p><b>　　R—稀釋倍數(shù)</b></p>

55、;<p>　　振蕩接觸24h后，比較對(duì)照樣與試樣燒瓶?jī)?nèi)的活菌濃度，按下式計(jì)算抑菌率：</p><p>　　Y=（Wt—Qt）/Wt ×100%</p><p><b>　　式中：</b></p><p><b>　　Y—試樣的抑菌率</b></p><p>　　Wt—對(duì)照樣2

56、4h振蕩接觸后燒瓶?jī)?nèi)的活菌濃度的平均值（CFU/mL）</p><p>　　Qt—抗菌試樣24h振蕩接觸后燒瓶?jī)?nèi)的活菌濃度的平均值（CFU/mL)</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　靈菌紅素作為一類(lèi)具有重要生物活性的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有較好的生物可降解性和環(huán)境相容性，因此，在高檔真絲制品、家紡產(chǎn)品、裝

57、飾用品等領(lǐng)域均具有巨大的應(yīng)用潛力，本次實(shí)驗(yàn)為靈菌紅素在抗菌織物方面的價(jià)值評(píng)價(jià)及開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)，加快靈菌紅素工業(yè)化進(jìn)程。</p><p>　　3.1 靈菌紅素對(duì)不同微生物抑菌性能的研究</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)用平板抑菌圈法定性的測(cè)定了靈菌紅素對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的抑制效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3-1~圖3-4和表3-1。</p><p&g

58、t;　　圖3-1：E.coli對(duì)靈菌紅素的抑菌圈結(jié)果示意圖 圖3-2：B.subtilis對(duì)靈菌紅素的抑菌圈結(jié)果示意圖</p><p>　　圖3-3：S.aureus對(duì)靈菌紅素的抑菌圈結(jié)果示意圖 圖3-4：P.aeruginosa對(duì)靈菌紅素的抑菌圈結(jié)果示意圖</p><p>　　表3-1：不同細(xì)菌對(duì)靈菌紅素的抑菌圈寬度 </p><p>　　從圖片可以看

59、到，在圓片狀濾紙片周?chē)梢钥吹矫黠@的抑菌圈。由表3-1中抑菌圈寬度可知，靈菌紅素對(duì)四種供試菌皆表現(xiàn)出一定的抑制作用，但在不同的菌種之間，其抑菌效果有差異。其中對(duì)B.subtilis的抑制效果最明顯，多次實(shí)驗(yàn)后其抑菌圈平均值為1.6 cm；S.aureus次之，抑菌圈為0.6 cm；而對(duì)E.coli抑制效果較弱，只微大于作為對(duì)照的含二甲亞砜溶液濾紙片的抑菌圈；如圖3-4所示，靈菌紅素對(duì)P.aeruginosa的抑菌圈分外圈和內(nèi)圈，內(nèi)圈完

60、全無(wú)菌生長(zhǎng)，外圈有一定量但少于普通含菌量的細(xì)菌生長(zhǎng)，因此靈菌紅素對(duì)銅綠假單胞菌在一定程度上有抑制作用。</p><p>　　3.2 靈菌紅素染色性能研究</p><p>　　3.2.1染色時(shí)丙酮與水的比例對(duì)上染率的影響</p><p>　　因靈菌紅素易溶于有機(jī)溶劑，本實(shí)驗(yàn)選用丙酮與水的混合溶液為溶劑，以真絲為試樣，在自然pH、常溫下染色60min，分別測(cè)定丙酮與水

61、在不同比例時(shí)的上染率，確定最佳溶劑比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3-5。染色時(shí)溶劑比對(duì)上染率的影響結(jié)果見(jiàn)表3-2和圖3-6。</p><p>　　圖3-5：丙酮與水不同比例下的染色結(jié)果</p><p>　?。◤淖蟮接冶c水的比例依次為1:4，1:3，1:3，1:1）</p><p>　　表3-2：染色時(shí)溶劑比對(duì)上染率的影響</p><p>　　圖3-6：

62、染色時(shí)溶劑比對(duì)上染率的影響</p><p>　　從表3-2、圖3-5和圖3-6可知，上染率隨著丙酮與水的比例逐漸增大而呈現(xiàn)先揚(yáng)后抑的趨勢(shì)。由于染料自身不溶于水，卻溶于丙酮溶液。當(dāng)溶液中丙酮濃度過(guò)低時(shí)，染料還未進(jìn)入織物就已溶出并開(kāi)始聚集，形成懸浮微粒，故上染率會(huì)降低；如果丙酮的量過(guò)多，染料會(huì)更易溶于溶劑中而難于被織物吸附，即達(dá)到染色平衡后上染的染料減少，不利于染色。</p><p>　　通過(guò)

63、實(shí)驗(yàn)得出最佳的丙酮與水的比例為1：2，此時(shí)染料的上染率最高，染后織物顏色鮮艷且均勻。</p><p>　　3.2.2染色溫度對(duì)上染率的影響</p><p>　　在上述條件即丙酮：水為1：2的溶劑比下，在自然pH下染色60min，測(cè)定不同溫度下的上染百分率，確定最佳染色溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3-7。染色時(shí)溶劑比對(duì)上染率的影響結(jié)果見(jiàn)表3-3和圖3-8。</p><p>　　

64、圖3-7：不同染色溫度下的染色結(jié)果</p><p>　?。◤淖蟮接覐南碌缴希来螢?0℃、55℃、70℃、85℃、100℃）</p><p>　　表3-3：染色溫度對(duì)上染率的影響</p><p>　　圖3-8：染色溫度對(duì)上染率的影響</p><p>　　從表3-3、圖3-7和圖3-8可知，隨著染色溫度的增加，上染曲線(xiàn)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到70

65、℃時(shí)，上染率達(dá)到最大，之后上染率開(kāi)始下降，曲線(xiàn)呈下降趨勢(shì)。由于溫度過(guò)低，染料難以進(jìn)入織物內(nèi)部透染、勻染；而溫度太高則加快丙酮揮發(fā)的速度，均不利染色。</p><p>　　通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出最佳的染色溫度為70℃，此時(shí)染料的上染率最高，染后織物顏色鮮艷且均勻。</p><p>　　3.2.3染液pH值對(duì)上染率的影響</p><p>　　在上述條件下即丙酮：水為1：2的溶劑比

66、，染色溫度為70℃染色60min，測(cè)定不同pH下的上染百分率，確定最佳染色pH。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3-9。染色時(shí)溶劑比對(duì)上染率的影響結(jié)果見(jiàn)表3-4和圖3-10。</p><p>　　圖3-9：不同染色pH下的染色結(jié)果</p><p>　?。◤淖蟮接覐纳系较聀H依次為：3、4、5、6、7、8、9）</p><p>　　表3-4：染液pH值對(duì)上染百分率的影響</p>

67、;<p>　　圖3-10：染液pH值對(duì)上染百分率的影響</p><p>　　從表3-4、圖3-8和圖3-10可知，當(dāng)pH約為6時(shí)，上染率最大，而后隨著pH值增大，上染率隨之下降。這可能是由于PG含甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)，不同pH使該結(jié)構(gòu)上基團(tuán)的供電子能力強(qiáng)弱不一，導(dǎo)致染料與織物的結(jié)合能力大小不一；而且PG在酸性介質(zhì)中較穩(wěn)定，在堿性環(huán)境下?lián)p失較大，因此造成不同pH條件下上染百分率的不同。</p>

68、;<p>　　此外，染色時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在不同的pH下，PG溶液的色澤也發(fā)生變化，酸性條件下呈鮮艷的紅色，而在堿性條件下則變?yōu)樽攸S色。</p><p>　　通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出最佳的染色pH為6，此時(shí)染料的上染率最高，考慮到綜合因素，選擇pH為6~7為最佳染色pH，染后織物顏色鮮艷且均勻。</p><p>　　3.3 經(jīng)染色整理后的織物其抗菌性能研究</p><p&g

69、t;　　3.3.1 平板抑菌圈法定性測(cè)染色后織物的抗菌性能：本實(shí)驗(yàn)以抑菌圈為考察指標(biāo)，采用定性的方法測(cè)定經(jīng)靈菌紅素染色后的織物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制效果，分別比較其抗菌性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3-11~圖3-14。經(jīng)過(guò)測(cè)量與計(jì)算平均值，得出結(jié)果見(jiàn)表3-5。</p><p>　　表3-5：染色后織物對(duì)不同細(xì)菌的抑菌圈寬度</p><p>　　圖3-11：大腸桿菌對(duì)靈菌紅素染色后織物的抑菌

70、圈結(jié)果 圖3-12：大腸桿菌對(duì)未染色織物的抑菌圈結(jié)果示意圖</p><p>　　圖3-13：S.aureus對(duì)靈菌紅素染色后織物的抑菌圈結(jié)果 圖3-14：S.aureus對(duì)未染色織物的抑菌圈結(jié)果示意圖</p><p>　　從圖片可以看到，在圓片狀染色織物周?chē)梢钥吹胶苄〉囊志?，而未染色織物則無(wú)。由表3-5中抑菌圈寬度可知，經(jīng)靈菌紅素染色整理后的織物對(duì)E.coli和S.aureus

71、均表現(xiàn)出一定的抑制作用，但其抗菌效果變差，且對(duì)不同的菌種抑菌效果有差異。其中對(duì)S.aureus的抑菌效果強(qiáng)于E.coli。</p><p>　　3.3.2 搖瓶振蕩法定量測(cè)染色后織物的抗菌性能：本實(shí)驗(yàn)以抑菌率為考察指標(biāo)，采用定量的方法測(cè)定經(jīng)靈菌紅素染色后的織物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制效果，分別比較其抗菌性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3-15~圖3-18。數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表3-6。</p><p>　

72、　表3-6：織物對(duì)E.coli和S.aureus抑菌率的測(cè)試結(jié)果</p><p>　　圖3-15：未染色織物的E.coli溶液稀釋106后涂布結(jié)果 圖3-16：染色織物的E.coli溶液稀釋106后涂布結(jié)果</p><p>　　圖3-17:未染色織物的S.aureus溶液稀釋106后涂布結(jié)果 圖3-18:染色織物的S.aureus溶液稀釋106后涂布結(jié)果</p>&

73、lt;p>　　表3-6：織物對(duì)E.coli和S.aureus抑菌率的測(cè)試結(jié)果</p><p>　　由表3-6可知，染色后的織物仍具有抗菌活性，其中對(duì)S.aureus有很強(qiáng)的抗菌作用，抑菌率達(dá)98%，對(duì)E.coli的抑制作用不如S.aureus菌強(qiáng)，但也有一定的抑制作用，抑菌率達(dá)47%。但其對(duì)E.coli的抑菌率并未達(dá)到GB/T 20944.3—2008中要求抗菌織物對(duì)E.coli和S.aureus的抑菌率&

74、gt;=70%。由此可以評(píng)價(jià)出經(jīng)靈菌紅素染色的絲綢確實(shí)有抗菌性，但其抑菌率并未達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　4.1 結(jié)果表明，靈菌紅素對(duì)四種供試菌均具有抑制效果，其中對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最明顯，金黃色葡萄球菌次之，對(duì)大腸桿茵抑制效果較弱，在一定程度上對(duì)銅綠假單胞菌有抑制作用。</p><p&

75、gt;　　4.2 確定靈菌紅素染真絲織物的最佳染色工藝條件：丙酮與水的比例為1:3，染色溫度70℃，染色pH6~7，染色60min。</p><p>　　4.3 染色后的織物仍具有抗菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率為98%，抑制作用強(qiáng)于大腸桿菌47%。但其對(duì)E.coli的抑菌率并未達(dá)到GB/T 20944.3—2008中要求抗菌織物對(duì)E.coli和S.aureus的抑菌率>=70%。</p>

76、<p>　　4.4 靈菌紅素作為微生物發(fā)酵產(chǎn)生的天然染料，在染色的同時(shí)又賦予織物一定的抗菌性，色澤鮮艷。作為一種綠色可持續(xù)的能源，應(yīng)用優(yōu)勢(shì)相當(dāng)明顯，在高檔真絲制品、保健內(nèi)衣、家紡產(chǎn)品、裝飾用品等領(lǐng)域中擁有廣闊的發(fā)展前景，巨大的商業(yè)潛力。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1]沈亞領(lǐng)，劉建文，魏東芝，等．靈菌紅素對(duì)人胰腺癌

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