食品科學(xué)與工程畢業(yè)論文魔芋低聚糖對(duì)acd小鼠皮膚內(nèi)微血管的影響

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　（20 屆）</b></p><p>　　魔芋低聚糖對(duì)ACD小鼠皮膚內(nèi)微血管的影響</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 食品

2、科學(xué)與工程 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b>&

3、lt;/p><p><b>　　摘要1</b></p><p>　　Abstract2</p><p><b>　　1 前言3</b></p><p>　　1.1 接觸性皮炎的研究進(jìn)展3</p><p>　　1.2 魔芋葡甘聚糖免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展3</p>

4、<p>　　2 實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器與試劑7</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料7</p><p>　　2.2 主要儀器7</p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)試劑7</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)方法8</b></p><p>　　3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及分組8<

5、/p><p>　　3.2 ACD小鼠模型制造8</p><p>　　3.3 降解魔芋葡甘聚糖制備8</p><p>　　3.4 給藥方法9</p><p><b>　　3.5 取材9</b></p><p><b>　　3.6 檢測(cè)9</b></p>&l

6、t;p>　　4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論11</p><p>　　4.1 魔芋葡甘低聚糖對(duì)ACD小鼠體重的影響11</p><p>　　4.2 魔芋葡甘低聚糖對(duì)ACD小鼠行為影響12</p><p>　　4.3 魔芋葡甘低聚糖對(duì)ACD小鼠脾臟的影響12</p><p>　　4.4 魔芋葡甘低聚糖對(duì)ACD小鼠對(duì)微細(xì)血管的影響12</

7、p><p><b>　　5 小結(jié)14</b></p><p>　　[摘要] 研究降解魔芋多糖（DAKP）對(duì)2，4一二硝基氯苯(DNCB)致小鼠急性過(guò)敏性皮炎（ACD）皮膚微血管的影響。方法將DNCB誘導(dǎo)的急性ACD小鼠隨機(jī)分成5組，空白組，模型組，低、中、高劑量DAKP組，每天分別灌胃給予蒸餾水、DAKP 2.0、3.0、4.0 g/(kg·d)，連續(xù)5w，

8、每周稱重一次。在實(shí)驗(yàn)?zāi)┝羧∵^(guò)敏性皮炎處皮膚做病理組織學(xué)檢查。結(jié)果：DAKP能明顯緩解ACD小鼠癥狀，中、高劑量組CD34+微血管數(shù)顯著性低于模型組。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 降解魔芋多糖（DAKP）；ACD小鼠；微細(xì)血管；免疫調(diào)節(jié)</p><p>　　Konjac oligosaccharide to ACD Imperceptible blood-vessel in mice w

9、ithin the influence of skin</p><p>　　[Abstract] Degradation of konjac of polysaccharide (DAKP) or two of 2,4 dinitrochlorobenzene (DNCB) induced acute allergic dermatitis (ACD) skin micrDNCBscular. Methods D

10、NCB induced acute ACD mice were randomly divided into 5 groups, control group, model group, low, medium and high dose DAKP group given distilled water were administered daily, DAKP 2.0,3.0,4.0 g / (kg ? d) Continuous 5w,

11、 once a week, weighing. At the end of the experiment specimens from the skin of atopic dermatitis at the patho</p><p>　　[Key words] Degradation of konjac polysaccharide (DAKP); ACD mice; Imperceptible blood-

12、vessel; immune regulation</p><p><b>　　前言</b></p><p>　　接觸性皮炎的研究進(jìn)展</p><p>　　接觸性皮炎（contact dermatitis，CD），是皮膚或粘膜暴露于單個(gè)或多個(gè)外源物質(zhì)后在接觸面或者其他部位出現(xiàn)炎癥，又被稱為環(huán)境和職業(yè)性皮膚炎[1-4]。它是目前醫(yī)學(xué)研究的一項(xiàng)重要

13、項(xiàng)目，所涉及的領(lǐng)域有臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、皮膚病學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)、化學(xué)工業(yè)、化妝品工業(yè)、食品和等。其表現(xiàn)主要有：丘疹、腫脹、水瘡、紅斑、剝脫性皮炎[1]。根據(jù)其病因、發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)，至少可將接觸性皮炎分為6種：1、過(guò)敏性接觸性皮炎；2、皮膚原發(fā)要刺激；3、速發(fā)型接觸反應(yīng)；4、外原性光毒性反應(yīng)及光變態(tài)反應(yīng)；5、非濕疹樣接觸性反應(yīng)；6、系統(tǒng)性接觸性反應(yīng)。</p><p>　　隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，職業(yè)和環(huán)境中越來(lái)越多的

14、致病因素暴露出來(lái)，導(dǎo)致許多新型的接觸性皮炎的產(chǎn)生，已嚴(yán)重影響生產(chǎn)和人民健康。正因它與人們的工作生活密切相關(guān)，所以已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。</p><p>　　根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)每年用于接觸性皮炎方面的費(fèi)用至少達(dá)200萬(wàn)——10億美元，主要用于生產(chǎn)、醫(yī)療及賠償?shù)幕ㄙM(fèi)[2]。從近幾年有關(guān)接觸性皮炎的研究中可以知道：CD尤其是ACD，是一類(lèi)主要由T細(xì)胞及其細(xì)胞因子功能失衡所引起的一種變態(tài)反應(yīng)性疾病，它是在多基

15、因遺傳背景和環(huán)境因素作用下所發(fā)生的[8-11]。有關(guān)研究顯示：ACD的發(fā)病機(jī)理不再是以往典型的IV型變態(tài)反應(yīng)，它的效應(yīng)細(xì)胞可以為CD8+ST也可以是CD4+T的Th2亞類(lèi)。在某些ACD發(fā)生過(guò)程中B細(xì)胞也會(huì)起重要作用[1]，其發(fā)病機(jī)理和異位性皮炎（atopic dermatitis,AD）以及濕疹（cczmea）存在著某些內(nèi)在的相關(guān)性[4-8]。因此，為尋找更有效的預(yù)防和治療手段，對(duì)ACD進(jìn)行研究十分有必要，這還對(duì)免疫學(xué)干預(yù)治療具有重要的

16、理論和實(shí)際意義。</p><p>　　魔芋葡甘聚糖免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展</p><p>　　魔芋(Amorphophallus konjac)為天南星科魔芋屬的多年生草本植物。它既可內(nèi)服，也可外用，具有治療咳嗽、氣喘、疝氣、乳房疼痛、燒傷以及血液和皮膚疾病的功效[12]。魔芋的塊莖中中含豐富的葡甘聚糖（Konjae Glucomannan, KGM），常用于中醫(yī)藥中，具有較高的藥用、食用價(jià)

17、值。KGM是由含D-葡萄糖和D-甘露糖結(jié)合的復(fù)合多糖。據(jù)現(xiàn)代研究表明：KGM具有抗衰老、調(diào)節(jié)胃腸道、降血脂、減肥、降血糖、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等諸多功效。在美國(guó)和歐洲，純化的魔芋粉已在食品添加劑和食品補(bǔ)充劑中推出使用[13]。</p><p>　　對(duì)于KGM的研究一直是研究的熱點(diǎn)。前人研究發(fā)現(xiàn)，免疫活性在KGM眾多生物學(xué)活性中是最為重要的。作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，可被應(yīng)用于腫瘤、病毒感染及超敏反應(yīng)性疾病的臨床治療[14,

18、15]。魔芋葡甘聚糖不僅能激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，還能調(diào)節(jié)體內(nèi)白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子的生成，活化補(bǔ)體等，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，在抗變態(tài)反應(yīng)性疾病、抗腫瘤等多方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[13-15]。</p><p><b>　　對(duì)免疫器官的影響</b></p><p

19、>　　免疫器官是執(zhí)行機(jī)體免疫功能的組織結(jié)構(gòu)，也是淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞發(fā)生、分化成熟、定居和增殖以及產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場(chǎng)所，其發(fā)育狀況直接影響到機(jī)體的免疫力。按功能不同，可分為中樞免疫器官（胸腺、腔上囊等）和外周免疫器官（脾臟、淋巴結(jié)等）。</p><p>　　對(duì)胸腺、脾臟的重量及脾臟細(xì)胞的增生方面的影響是KGM對(duì)免疫器官發(fā)育的影響的主要表現(xiàn)。王玲等[16]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)魔芋精粉（AKP）對(duì)胸腺指數(shù)和脾指數(shù)具有增

20、高作用，可明顯促進(jìn)小鼠免疫功能。Wang[17]報(bào)道，劑量在0.3～50 g/mL之間分子量大于10kDa的KGM酸降解物可顯著促進(jìn)小鼠脾臟細(xì)胞的增生，具有增強(qiáng)初級(jí)免疫反應(yīng)的能力。由此可見(jiàn)，KGM可以促進(jìn)正常和免疫低下的動(dòng)物免疫器官的發(fā)育，進(jìn)而提高機(jī)體的免疫力。</p><p>　　對(duì)T、B淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用</p><p>　　1.2.2.1 對(duì)T細(xì)胞的影響</p>

21、<p>　　在維持機(jī)體的免疫平衡和免疫監(jiān)視功能中，T細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)功能扮演了重要的角色，對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫起主導(dǎo)作用。Wang[17]研究發(fā)現(xiàn)KGM酸降解物能顯著活化小鼠初始T細(xì)胞（native T cell），該類(lèi)KGM酸降解物為5～100g/mL分子量小于10kDa。而在Mizutani[18]等的報(bào)道中也有指出，魔芋精粉對(duì)小鼠機(jī)體有免疫增強(qiáng)作用，可以荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞增殖能力，進(jìn)而降低小鼠瘤體重量。</p>

22、<p>　　此外，根據(jù)所分泌的細(xì)胞因子不同，輔助性T細(xì)胞（Th）被分成Th1和Th2。Th1/Th2比值的動(dòng)態(tài)平衡是保證正常免疫功能的重要因素，在清除病毒和腫瘤，誘導(dǎo)免疫耐受等方面起著重要作用，所以需維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[19]。Suzuki Y[20]等通過(guò)流氏細(xì)胞儀分析致敏小老鼠脾細(xì)胞亞群，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示證實(shí)喂養(yǎng)葡甘聚糖的過(guò)敏小鼠Th1/Th2比例明顯改善，葡甘聚糖可使小老鼠體內(nèi)Th1從2.91％升至4.02％，而Th2

23、細(xì)胞則從3.75％降至2.72％；同時(shí)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的分化比例從14.5％上升到18.7％。而在Onishi[21]等的免疫實(shí)驗(yàn)也表明，細(xì)微粉碎的KGM（PKGM）對(duì)Th1/Th2的比例起著正向調(diào)控作用，可以防止過(guò)敏性皮炎小鼠模型的皮膚炎癥。</p><p>　　可見(jiàn)，KGM可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化，維持Th1/Th2比例平衡，從而提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。</p><p>　　1

24、.2.2.2 對(duì)B細(xì)胞的影響</p><p>　　B淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，是免疫系統(tǒng)的重要組成細(xì)胞。KGM對(duì)機(jī)體B淋巴細(xì)胞的活性具有一定的影響作用，可以調(diào)節(jié)B細(xì)胞分泌抗體的能力，尤其是對(duì)變態(tài)反應(yīng)機(jī)體特異性抗體生成的量有明顯抑制作用。注射水解KGM對(duì)卵清蛋白（DNCB）致敏的Balb/c小鼠B細(xì)胞產(chǎn)IgE能力具有一定的影響，Hidenori Suzuki[22]等發(fā)現(xiàn)用0.25 N鹽酸水解，大小介于1

25、0和500 kDa的KGM小鼠注射液能夠抑制血漿總IgE和IgG1。Onishi[21]等的免疫實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)微粉碎的KGM(PKGM)能明顯減少變應(yīng)性鼻炎模型小鼠的抓鼻和噴嚏數(shù)，抑制DNCB刺激引起的B淋巴細(xì)胞增殖，降低血清總IgE和DNCB特異性IgE含量，防止特應(yīng)性皮炎小鼠模型的皮膚炎癥。而Oomizu[23]等人在研究PKGM降低DNCB致敏小鼠血漿特異性IgE的機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，KGM是通過(guò)抑制B細(xì)胞IgE表達(dá)的開(kāi)關(guān)來(lái)降低血漿總IgE

26、含量的。此外，KGM能明顯抑制NC/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎（AD）模型濕疹的發(fā)展。Nobukazu Onishi[24]等研究發(fā)現(xiàn)KGM可以控制NC/Nga小鼠血清類(lèi)風(fēng)濕因子IgG抗體和B細(xì)胞激活</p><p><b>　　對(duì)細(xì)胞因子的影響</b></p><p>　　對(duì)細(xì)胞因子的影響是KGM免疫調(diào)節(jié)的又一個(gè)重要機(jī)制。細(xì)胞因子是一種多功能活性蛋白質(zhì)或糖蛋白，由免疫活化

27、細(xì)胞產(chǎn)生。它能調(diào)節(jié)細(xì)胞分化增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)揮其功能，在機(jī)體免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用[25]。</p><p>　　大量實(shí)驗(yàn)證明，KGM可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞因子的活化，從而提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。Wang[17]研究KGM及酸降解物免疫活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，分子量大于10 kDa的KGM酸降解物可顯著增加NO、IL-6及TNF-的表達(dá)，同時(shí)還增強(qiáng)小鼠骨髓細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)（CD11c，CD40，CD80，CD86），增加細(xì)胞

28、因子IL-1和樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的趨化因子的產(chǎn)生。王玲等[16]將小鼠巨噬細(xì)胞用LPS（10μｇ/ｍL）孵育18～24ｈ后，培養(yǎng)上清中IL-1和TNF-α水平均隨KGM濃度的增加而增加，表明KGM對(duì)巨噬細(xì)胞合成和釋放IL-1和TNF-α具明顯促進(jìn)作用。呂正光[26]通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KGM對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IFN -γ/IL-4的比值失衡有明顯的調(diào)理作用，此外，Oomizu的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)PKGM可以減少小鼠IL-4和IFN-γ的基因表

29、達(dá)水平，進(jìn)而影響細(xì)胞因子的表達(dá)。Hidenori Suzuki[24]等研究發(fā)現(xiàn)水解KGM可以促進(jìn)單核細(xì)胞分泌IFN -γ，可顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF和IL - 1的能力。李映麗[25]等給昆明系小鼠灌胃，持續(xù)25d,觀察魔芋甘露聚糖對(duì)其免疫功能影響。</p><p>　　Onishi N[27]等給4周齡NC/Nga小鼠喂食魔芋葡甘聚糖8至9周，每2個(gè)星期對(duì)其搔抓行為和臨床癥狀進(jìn)行評(píng)估。從第6周開(kāi)始，

30、PKGM喂養(yǎng)的小鼠的搔抓行為明顯減少，且這種癥狀是呈劑量依賴性的。連續(xù)PKGM喂養(yǎng)還可以顯著抑制小鼠皮膚細(xì)胞角化，對(duì)皮膚肥大細(xì)胞增生及嗜酸細(xì)胞增多的濕疹皮膚病灶有明顯改善。同時(shí)，血清P物質(zhì)（局部炎性細(xì)胞因子），IL-10水平和IL-4和TNF-α與對(duì)照組相比也均顯著降低（P<0.01）。</p><p>　　對(duì)腸道免疫功能的調(diào)節(jié)作用</p><p>　　1.2.4.1 對(duì)腸粘膜抗體產(chǎn)

31、生的調(diào)節(jié)</p><p>　　腸道黏膜免疫構(gòu)成機(jī)體防止腸道感染的第一道防線，腸道免疫屏障也是腸黏膜屏障的重要組成部分。Yamada K[28]等研究表明KGM喂養(yǎng)的小鼠腸系膜淋巴細(xì)胞產(chǎn)IgA和IgG水平比其他喂養(yǎng)組明顯增高，認(rèn)為KGM對(duì)機(jī)體免疫功能的增強(qiáng)，這主要表現(xiàn)在腸道免疫系統(tǒng)。史艷莉[29]等通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)證明KGM對(duì)大負(fù)荷訓(xùn)練大鼠粘膜SIgA具有一定的影響，在大負(fù)荷訓(xùn)練期間補(bǔ)充KGM可以調(diào)節(jié)和提高訓(xùn)練機(jī)體的腸

32、粘膜IgA的免疫屏障功能。他們對(duì)大鼠通過(guò)8周大負(fù)荷訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)，喂食KGM大鼠的血漿內(nèi)毒素、腸粘膜通透性和細(xì)菌移位率升高，小腸IgA漿細(xì)胞個(gè)數(shù)、平均光密度和腸液SIgA含量均顯著高于大負(fù)荷訓(xùn)練對(duì)照組（P<0.05）。</p><p>　　1.2.4.2 對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)</p><p>　　腸道內(nèi)的正常菌群數(shù)量龐大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜。在維持正常免疫功能方面，正常腸道菌群能促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育，發(fā)揮

33、重要作用。Chen HL[30]通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)表明，魔芋膳食補(bǔ)充可以提高病人對(duì)疾病的免疫力，明顯改善病人排便及結(jié)腸生態(tài)。Chen HL[31]通過(guò)給7周齡雄性Balb/c小鼠喂食2.5％、5％、和7.5％的KGM及酸水解物，研究KGM與其酸水解物對(duì)盲腸和糞便菌群的影響。實(shí)驗(yàn)表明，KGM及酸水解物可以通過(guò)改善Balb/c小鼠腸道菌群環(huán)境進(jìn)而增強(qiáng)小鼠免疫力。所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：小鼠的盲腸厭氧菌和雙歧桿菌數(shù)量在第2周和第4周時(shí)分別比對(duì)照組明顯增加

34、；盲腸產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量在第4周顯著降低；而在第周2和第4周時(shí)，盲腸醋酸和丙酸濃度含量也分別增加；另外，只需2.5％的KGM量即可增加腸道雙歧桿菌數(shù)量。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器與試劑</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)小鼠</b></p><p&

35、gt;　　清潔級(jí)ICR小鼠，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)scxk（浙）20080033，常規(guī)飼食喂水，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前禁食不禁水14h。</p><p><b>　　主要試劑及儀器</b></p><p>　　丙酮，2，4一二硝基氯苯(DNCB)，硫化鈉（西亞試劑公司），氯雷他定（國(guó)藥準(zhǔn)字H20041044,湖北絲寶藥業(yè)有限公司）。戊巴比妥鈉(美國(guó)Bioszune)，魔芋葡

36、甘聚糖（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)院提供）。</p><p><b>　　主要儀器</b></p><p>　　儀器名稱 型號(hào) 產(chǎn)地</p><p>　　立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 LDZX—40BI型 上海申安醫(yī)療器械廠</

37、p><p>　　冰箱 BCD-236H Sanyo</p><p>　　旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器 DSHZ—300A型 江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)儀器廠</p><p>　　精密pH計(jì) pHS-3C型 上海精密科學(xué)儀器有限

38、公司</p><p>　　電子天平 BS110S 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司</p><p>　　數(shù)顯式電熱恒溫干燥器 202-S 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司</p><p>　　超凈工作臺(tái) ESCO

39、 上海金鵬分析儀器有限公司</p><p>　　電子分析天平 BS110 北京賽多利斯天平有限公司</p><p>　　電熱恒溫液浴鍋 HHS型 上海棱光技術(shù)有限公司</p><p>　　顯微鏡 BH-2

40、 Olympus</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)試劑</b></p><p>　　試劑名稱 級(jí)別 生產(chǎn)廠家</p><p>　　丙酮 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司&

41、lt;/p><p>　　DNCB 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　硫化鈉 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　氯雷他定 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限

42、公司</p><p>　　磷酸二氫鉀 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　七水硫酸鎂 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　磷酸銨 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p>

43、<p>　　氯化鈣 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　氯化鈉 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及分組</

44、b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)</b></p><p>　　從浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)回來(lái)清潔級(jí)ICR小鼠一共50只，放于試驗(yàn)用動(dòng)物飼養(yǎng)房。選用4只白色塑料飼養(yǎng)箱，用清水洗凈飼養(yǎng)箱，放于干燥處晾干。在4只飼養(yǎng)箱中墊入約2cm厚度的木刨花，木刨花要選擇無(wú)毒、無(wú)異味、吸濕性好、油脂、粉塵少的非松木刨花。墊料在使用之前先過(guò)篩，粉塵和粗大玉米秸稈、刨花去掉

45、，再經(jīng)132℃，5min高壓蒸汽滅菌干燥4min后使用。把50只小鼠平均放入飼養(yǎng)箱中，蓋好網(wǎng)格蓋子。取4只經(jīng)滅菌的飼養(yǎng)飲水瓶，飲水瓶各倒入蒸餾水200ml，放入飼養(yǎng)箱。14h后各放入實(shí)驗(yàn)用飼養(yǎng)飼料350g，并觀察飲水瓶水量，把剩余的水倒掉，之后重新加入蒸餾水200ml。</p><p>　　每周更換墊料兩次，換上經(jīng)洗刷消毒過(guò)的飼養(yǎng)箱和墊料。換出的廢墊料用垃圾袋裝好及時(shí)扔掉以免產(chǎn)生臭味。清理的過(guò)程中需要帶一次性塑膠

46、手套，每更換一個(gè)飼養(yǎng)箱之后在消毒液里清洗一下手套，以防止交叉污染。在清洗飼養(yǎng)箱過(guò)程中取出仔細(xì)觀察小鼠，如果發(fā)現(xiàn)可疑傷病動(dòng)物，立即將其移出飼養(yǎng)箱，待查原因。清理?yè)Q窩過(guò)程中，如果有動(dòng)物掉到地上，不再放回飼養(yǎng)箱，隨污物傳出室外，淘汰處理。每天早上7點(diǎn)，中午12點(diǎn)，晚上6點(diǎn)檢查添加飼料，不可一次添得過(guò)多，每次加入200g，以保持飼料的新鮮和避免浪費(fèi)，掉到地上的飼料不可再用，清掃收集傳出室外。同時(shí)檢查飲水瓶中蒸餾水的水量，每天定時(shí)倒出剩余的水，加

47、入新鮮蒸餾水200ml。</p><p>　　每天早上在檢查完小鼠后，用消毒液擦拭飼養(yǎng)房的走廊及出入口的窗臺(tái)、地面，每周徹底清掃、消毒一次，做到窗明幾凈不留死角。每次進(jìn)入飼養(yǎng)房前穿好工作服，帶好工作帽、工作口罩與一次性塑膠手套，以減少污染。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組</b></p><p>　　將50只小鼠隨機(jī)分為5組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，

48、每組小鼠平均體重25g：空白組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只；實(shí)驗(yàn)開(kāi)始即對(duì)每組小鼠灌胃，低劑量組為降解魔芋多糖用量為2. 0 g/(kg·d)；中劑量組為降解魔芋多糖用量為3. 0 g/(kg·d)；高劑量組為降解魔芋多糖用量為4. 0 g/(kg·d)。</p><p><b>　　ACD小鼠模型制造</b></p><

49、p>　　各組小鼠均在背部和腹部取2×2cm2范圍用硫化鈉脫毛，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1天，用加樣器量取7%DNCB溶液25ul，用棉球涂均勻的抹于實(shí)驗(yàn)組小鼠腹部致敏，第2天再?gòu)?qiáng)化一次。第7天在鼠背部脫毛區(qū)涂抹1%DNCB溶液5ul激發(fā)。24h后可造成小鼠背部急性ACD模型?？瞻捉M小鼠也同上涂抹等量蒸餾水。</p><p>　　降解魔芋葡甘聚糖制備</p><p>　　在500mL甲醇

50、中投入魔芋葡甘聚糖50 mg，以2mol/L加入氫氧化鈉，在恒溫磁力攪拌器中，70℃，攪拌12h。冷卻至室溫，以鹽酸調(diào)pH值至3，70℃，繼續(xù)加熱攪拌24h，以氫氧化鈉調(diào)pH值至中性。減壓蒸發(fā)去掉甲醇，按1：5的體積比加入950mL/L乙醇沉淀過(guò)夜。過(guò)濾，凍干即得DAKP。</p><p><b>　　給藥方法</b></p><p>　　灌藥自致敏前l(fā)d開(kāi)始，各組小

51、鼠均每日給藥1次，每次灌胃量為0.4ml。ACD模型再于激發(fā)前2h及激發(fā)后6h灌藥1次。各量組分別：降解魔芋多糖在灌胃低劑量組時(shí)的用量為2. 0 g/(kg·d)；降解魔芋多糖在灌胃中劑量組的為用量為3. 0 g/(kg·d)；降解魔芋多糖在灌胃高劑量組的用量為4. 0 g/(kg·d);使用氯雷他定組灌服4倍的等效量氯雷他定，模型組要用等量蒸餾水灌胃。</p><p>　　小鼠灌胃

52、方法：保持小鼠的頭部和頸部成一直線，方便灌胃針頭進(jìn)入，動(dòng)作要輕柔，從口角進(jìn)入，防止損失食道。之后準(zhǔn)備好灌胃的針頭。一般可從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)，如果沒(méi)有的話，用12號(hào)的針頭，把12號(hào)的針頭針尖剪去，然后將剪去的頭端磨掉磨平。市面上買(mǎi)的灌胃針頭的頭端是用錫或者其他方法處理好了的銳口，而自己是不可能將所有的尖頭都磨掉的，因而使用這種針頭灌胃，可能會(huì)造成小鼠食道的損傷。抓小鼠的動(dòng)作也很簡(jiǎn)單，用左手的小指和無(wú)名指抓住小鼠的尾巴，用其他的三個(gè)手指抓住小鼠的

53、頸部。因?yàn)樾∈笫冀K在活動(dòng)中，如果一次抓的感覺(jué)不是很順手，就要放開(kāi)重新抓，切記不要逞強(qiáng)而進(jìn)行下一步的操作。之后就抓好小鼠就可以灌胃了，一般是用1ml的注射器裝上灌胃針頭。灌胃針頭是從小鼠的嘴角進(jìn)入，首先要壓住舌頭，抵住上顎，輕輕向內(nèi)推進(jìn)，進(jìn)入食管后會(huì)有一個(gè)刺空感，之后進(jìn)入食道后就可以推注藥液了，灌胃的針頭也可以是再往里面深入一點(diǎn)，以防止藥液從口中流出。灌胃容積一般是0.1～0.2ml/10g，最大0.35ml/10g，每只小鼠的灌胃最大容

54、積不超過(guò)0.8ml。</p><p><b>　　取材</b></p><p>　　急性模型激發(fā)后24h，小鼠背部皮膚潮紅、腫脹、增厚，或有滲出、結(jié)癡；慢性模型激發(fā)后72h，小鼠背部皮膚呈片狀紅斑，皮膚表面粗糙、角化、脫屑。以上癥狀符合急、慢性ACD的臨床表現(xiàn)，說(shuō)明造模成功。小鼠摘眼球取血，脫頸處死。小鼠處死后于注射點(diǎn)周?chē)?cm內(nèi)剪毛后剪取鼠皮膚,生理鹽水沖洗后置于B

55、oun's液中固定48h,常規(guī)水、包埋，6μm石蠟切片。</p><p><b>　　檢測(cè)</b></p><p><b>　　小鼠的體重變化</b></p><p>　　測(cè)量實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中的第1、第7、第14、第21、第28天和第35天各組小鼠的體重，并進(jìn)行比較。</p><p><b&

56、gt;　　小鼠行為變化</b></p><p>　　觀察實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中的第1、第7、第14、第21、第28天和第35天各組小鼠行為的變化，并進(jìn)行比較。</p><p>　　小鼠胸腺和脾臟重量的影響</p><p>　　測(cè)量實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中的第1、第7、第14、第21、第28天和第35天各組小鼠的體重，并進(jìn)行比較。</p><p>　　微血管

57、的顯示與密度測(cè)定</p><p>　　取各組小鼠皮膚組織切片,常規(guī)脫蠟至水,用EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)后,按照SP法進(jìn)行CD34免疫組織化學(xué)染色,一抗為兔抗鼠CD34單克隆抗體(1∶100稀釋),對(duì)照組以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)代替一抗。二氨基聯(lián)苯氨(diaminobenzidine,DAB)顯色,蘇木精復(fù)染,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡觀察。每

58、組隨機(jī)選取5張切片,每張切片于200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,拍照記錄。然后參照Weidner方法,以陽(yáng)性著色、與背景明顯有別的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)(血管斷面管徑小于8個(gè)紅細(xì)胞直徑)作為一個(gè)計(jì)數(shù)單位,利用Motic imagesadvanced 3.2圖像分析軟件計(jì)算單位面積(mm2)內(nèi)的微血管數(shù)量。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論</b></p><p>

59、　　魔芋葡甘低聚糖對(duì)ACD小鼠體重的影響</p><p>　　圖1 各組小鼠體重折線圖</p><p>　　表1 各組小鼠體重的變化</p><p>　　魔芋葡甘低聚糖對(duì)ACD小鼠行為影響</p><p>　　魔芋葡甘低聚糖對(duì)ACD小鼠脾臟的影響</p><p>　　與空白組比較，低劑量魔芋葡甘低聚糖組(3g/kg.

60、d)小鼠胸腺和脾臟重量均顯著增加P（<0.01）；而高劑量魔芋葡甘低聚糖組（5g/kg.d）與空白組比較，對(duì)小鼠胸腺的抑制作用較明顯（P<0.01），與氯雷他定組比較（P>0.05），并無(wú)顯著性差異；而高劑量魔芋葡甘低聚糖不影響脾臟的重量(P>0.05)，見(jiàn)表2。</p><p>　　表2 各組小鼠脾臟重量的變化</p><p><b>　　各組小鼠脾臟

61、的影響</b></p><p>　　圖4 正常對(duì)照組小鼠的內(nèi)臟 圖5 喂藥實(shí)驗(yàn)組小鼠的內(nèi)臟</p><p>　　魔芋葡甘低聚糖對(duì)ACD小鼠對(duì)微細(xì)血管的影響</p><p>　　顯微鏡觀察DNCB組和對(duì)照組大鼠皮膚切片顯示,DNCB刺激后皮膚表皮增生,真皮內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),淺筋膜和皮肌處出現(xiàn)炎性灶,表明DNCB對(duì)大鼠皮膚的致炎

62、效果可靠。采用CD34免疫組化對(duì)致敏部位皮膚微血管染色顯示,CD34+微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕黃色,DNCB致敏后誘導(dǎo)其陽(yáng)性著色增強(qiáng),而APS則對(duì)其誘導(dǎo)有明顯下調(diào)作用。對(duì)不同處理組小鼠真皮內(nèi)微血管數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析表明,與對(duì)照組比較,DNCB組CD34+微血管數(shù)極顯著性增多,APS組無(wú)顯著性變化;APS+DNCB組CD34+微血管數(shù)顯著性低于DNCB組,與對(duì)照組間無(wú)顯著性差異。</p><p><b>　　小結(jié)&l

63、t;/b></p><p>　　在多基因遺傳背景和環(huán)境因素作用下CD尤其是ACD是一種，主要由T細(xì)胞及其細(xì)胞因子功能失衡所引起的一種變態(tài)反應(yīng)性疾病。當(dāng)代研究表明[32-34]，CD34是當(dāng)前最常用的微血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物,但是機(jī)體處功能狀態(tài)與CD34表達(dá)量的高低相關(guān),在疾病狀態(tài)，例如腫瘤,CD34表達(dá)上調(diào),而在正常生理狀態(tài)下,CD34表達(dá)量較低。另外,CD34在炎癥反應(yīng)的發(fā)生和淋巴細(xì)胞的歸巢中起著重要介導(dǎo)作用

64、。據(jù)報(bào)道, 魔芋葡甘聚糖能夠在一定程度上抑制白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用。</p><p>　　本試驗(yàn)結(jié)果顯示,灌胃降解魔芋葡甘聚糖能夠顯著降低DNCB誘導(dǎo)的小鼠皮膚內(nèi)CD34+微血管數(shù)量;結(jié)果提示, 降解魔芋葡甘聚糖對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)CD34的下調(diào)可能是其抑制白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附,而產(chǎn)生對(duì)炎癥與免疫反應(yīng)調(diào)控作用的機(jī)制之一。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</

65、b></p><p>　　[1] 李林峰. 接觸性皮炎與皮膚變態(tài)反應(yīng). 第二版. 北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2003.3-49.</p><p>　　[2] MathiasCGT. The cost of occupational skin disease. Aich Dermatol,1985,121:332~333.</p><p>　　[3] Rose

66、n R and Freeman S.Occupational contact dermatitis in New South Wales.Austraalas J of dermatol.1992，23:1~10.</p><p>　　[4] Ian Kimber，Dvaid A. Basketter Allergic contact dermatitis (Review)，International Immun

67、opharmacology 2(2002)，201~211</p><p>　　[5] 劉藕根何黎 淋巴細(xì)胞對(duì)小鼠接觸變應(yīng)性光皮炎的影響.中華皮膚科志2004 37(6):341~343</p><p>　　[6] Donald YM Leung，Neal Jain and Havrey L Leo. New conccpts in the Pathogenesis of atopic d

68、ermatitis，Current Opinion in Immunology 2003 15:634~638</p><p>　　[7] Akhavan BA. The relationship between atopic dermatitis and contact dermatitis.Clinics in Dermatology 2003，21:158~162.</p><p>

69、　　[8] Kimber I，Dearman RJ，Cumberbatch M，Huby RJD. Lngerhans cells and chemical allegry. Curr Opin Immunol 1998，10:614~619.</p><p>　　[9] Kimber I，Cumberbatch M. Cytokines and chemokines in the initiation and

70、regulation of epidermal Langerhans cell mobilization.Br J Demratol 2000，142:401~412.</p><p>　　[10] Cumberbatch M，Dearman RJ，Kimber I. Langerhans cell require signals form both tumour necrosis factor-αand int

71、erleukin-1βfor migration. Immunology 1997，92:388~95.</p><p>　　[11] Cumberbatch M，Dearman RJ，AntonoPoulos C，Groves RW，Kimber I. Interleukin(IL)-18 induces Langerhans cell migration by a tumour necrosis factor

72、-αand IL-1β-dependent mechanism. Immunology 2001,102:323~30</p><p>　　[12] Keithley J, Swanson B. Glucomannan and obesity: a critical review [J].Therapies in Health and Medicine, 2005, 11:30–4.</p><

73、;p>　　[13] Chua M, Baldwin TC, Hocking TJ, et al. Traditional uses and potential health benefits of Amorphophallus konjac K. Koch ex N.E.Br [J]. J Ethnopharmacol, 2010, 128(2):268-78.</p><p>　　[14] Mosmann

74、 T. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival :Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability[J]. J Immunol Methods ,1986 ,89 (2) :271-7.</p><p>　　[15]

75、 Liu H. Therapeutic effect of konjac gloucomanan on experimental obesity and diabetic mice[J]. Acta Nutr Sin, 2002, 24 (4): 437 - 9.</p><p>　　[16] 王玲,王國(guó)燕,鄧學(xué)瑞.蘑芋精粉對(duì)小鼠免疫器官和細(xì)胞因子水平的影響[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1998,22(4)

76、: 139-41.</p><p>　　[17] Wang JZ. Bioactive structure and molecular property of konjac glucomannan: immunomodulatory viewpoint [D]. Institute of Food and Nutrition, Providence University Dissertation ,2009<

77、;/p><p>　　[18] LiL,BoussiotisVA.Control and regulation ofperipheral tolerance in allergic iflammatory disease: therapeutic consequences [ J]. Chem Immunol Allerg, 2008, 94: 178-88.</p><p>　　[19] Su

78、zuki Y, Kassai M, Hirose T. Modulation of Immunoresponse in BALB/c Mice by Oral Administration of Fage 1-Glucomannan Conjugate [J] . Agric Food Chem, 2009 , 1:787-92.</p><p>　　[20] Onishi N, Kawamoto S, Ued

79、a KDietary pulverized konjac glucomannan prevents the development of allergic rhinitis-like symptoms and IgE response in mice [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2007 ,71(10):2551-6.</p><p>　　[21] Hidenori Suzuk

80、i, Souichi Oomizu, Yuhki Yanase. Hydrolyzed Konjac Glucomannan Suppresses IgE Production in Mice B Cells [J] .Int Arch Allergy Immunol,2010,152:122-30.</p><p>　　[22] Oomizu S, Onishi N, Suzuki H, et al. Oral

81、 administration of pulverized Konjac glucomannan prevents the increase of plasma immunoglobulin E and immunoglobulin G levels induced by the injection of syngeneic keratinocyte extracts in BALB/c mice [J]. Clin Exp Aller

82、gy, 2006 , 36(1):102-10.</p><p>　　[23] Nobukazu Onishi, Seiji Kawamoto, Masaru Nishimura,et al. A New Immunomodulatory Function of Low-Viscous Konjac Glucomannan with a Small Particle Size: Its Oral Intake S

83、uppresses Spontaneously Occurring Dermatitis in NC/Nga Mice [J]. Int Arch Allergy Immunol, 2005, 136:258-65</p><p>　　[24] Delrete G. The concept of type1 and type helper T cells and their cytokines in human

84、s. IntRev Immuno,l 1998, 16: 427-55.</p><p>　　[25] 李映麗,吳萬(wàn)興,鮑德虎,等. 魔芋甘露聚糖免疫作用的研究[J]. 陜西林業(yè)科技.1999,24 (17)568-72.</p><p>　　[26] 呂正光. 植物多糖免疫調(diào)節(jié)的希望靶點(diǎn)_甘露糖受體[D].第四軍醫(yī)大學(xué),2006.</p><p>　　[27] O

85、nishi N, Kawamoto S, Suzuki H, et al. Dietary pulverized konjac glucomannan suppresses scratching behavior and skin inflammatory immune responses in NC/Nga mice [J]. Int Arch Allergy Immunol, 2007, 144(2):95-104.</p&g

86、t;<p>　　[28] Yamada K, Tokunaga Y, Ikeda A, et al. Effect of dietary fiber on the lipid metabolism and immune function 29 of aged Sprague-Dawley rats [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2003, 67(2):429-33.</p>

87、<p>　　[29] 史艷莉,費(fèi)曦艷,余輝. 魔芋甘露聚糖對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激大鼠腸粘膜屏障的保護(hù)作用[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 26(5):580-5.</p><p>　　[30] Chen HL,Cheng HC,Wu WT,et al.Supplementation of konjac glucomannan into a low fiber Chinese diet promoted bow

88、el movement and improved colonic ecology in constipated adults: aplacebo-controlled, diet-controlled trial [J]. J Am Coll Nutr, 2008, 27:102-8.</p><p>　　[31] 竇肇華,張遠(yuǎn)強(qiáng),郭順根.免疫細(xì)胞學(xué)與疾病[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2004:667-669

89、.</p><p>　　[32] Mierke C T,Ballmaier M,Werner U.Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells[J].J Exp Med,2000,192(6):801-811.</p><p>　　[33] Nakae S,Suto H,Kak

90、urai M,et al.Mast cells enhance T cell activation:importance of mast cell-derived TNF [J].PNAS,2005,102(18):6467-6472.</p><p>　　[34] Thomas G B,Camillo D G.Prolonged exposure to hyperoxia increases perivascu