振通膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

1、<p>　　振通膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響</p><p>　　作者：滿偉，王敬蘭，占戈，王鑫國，曹剛</p><p>　　【摘要】 目的觀察振通膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響。方法采用夾閉大鼠兩側(cè)頸總動脈（同時腹腔注射硝普鈉）缺血45 min，再灌注30 min的方法復(fù)制大鼠腦缺血再灌注損傷模型。結(jié)果振通膠囊（0.07，0.14 g/kg）可明顯升高腦缺血再灌注大鼠血

2、清SOD，6ketoPGF1α含量，降低MDA，ET，TXB2及腦鈣含量。結(jié)論 振通膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷有明顯保護(hù)作用。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 振通膠囊； 腦缺血再灌注損傷</p><p>　　振通膠囊是我們研制的治療中風(fēng)后遺癥的中藥復(fù)方制劑，由馬錢子等中藥組成。臨床試用取得了良好的療效。為探討其作用機(jī)制，我們觀察了其對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響。現(xiàn)報道如下。<

3、;/p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>　　1.1 藥物和試劑振通膠囊（0.5 g/粒），由課題組提供，用0.5%的纖維素鈉制成混懸液，備用；硝普鈉，北京制藥工業(yè)研究所實驗廠，用無菌蒸餾水溶解；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程公司；血栓素B2（TXB2）、6酮前列腺素F1α（6ketoPGF1α）、

4、一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素（ET）試劑盒，解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所。</p><p>　　1.2 動物雄性Wistar大鼠，32只，體重（306±15）g，和平醫(yī)院實驗動物中心提供。</p><p>　　1.3 實驗方法健康雄性Wistar大鼠32只，隨機(jī)分為4組。分別為偽手術(shù)組（手術(shù)，但不結(jié)扎血管，不注射硝普鈉）、腦缺血再灌注模型對照組、振通膠囊低劑量組（0.07 g/

5、kg）、振通膠囊高劑量組（0.14 g/kg）。各給藥組均灌胃給藥，容量為1 ml/100 g體重。偽手術(shù)組及模型對照組灌服等量蒸餾水，連續(xù)7 d。在末次灌胃后2 h，在10%水合氯醛麻醉下（35 mg/kg，ip），分離并用無損傷動脈夾夾閉大鼠兩側(cè)頸總動脈，同時迅速腹腔注射硝普鈉（2.5 mg/kg，ip），缺血45 min后，將頸總動脈松開，再灌注30 min。</p><p>　　1.4 指標(biāo)檢測方法&l

6、t;/p><p>　　1.4.1 SOD，MDA含量的測定模型成功后，腹主動脈取血2 ml，3 000 r/min，4℃離心10 min，取血清按說明書方法測定其中SOD，MDA含量。</p><p>　　1.4.2 NO，ET含量測定模型成功后，腹主動脈取血2 ml，注入含10%EDTA-鈉30 μl和抑肽酶40 μl的試管中，混勻，3 000 r/min，4℃離心10 min，取血

7、漿按說明書用放免法測定其中NO，ET含量。</p><p>　　1.4.3 TXB2，6ketoPGF1α含量測定模型成功后，腹主動脈取血2 ml，放入加有消炎痛-EDTA·Na2液的試管中，即刻混勻，3 000 r/min，4℃離心10 min，取血漿按說明書用放免法測定其中TXB2，6ketoPGF1α含量。</p><p>　　1.4.4 腦組織鈣含量測定灌注

8、完畢后斷頭，開顱取右側(cè)大腦皮層，用去離子水清洗后，烘干研末，經(jīng)優(yōu)級硝酸消化后按原子吸收分光光度法，以shimadzu AA680G型原子吸收分光光度計測定腦組織鈣含量。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 對腦缺血再灌注大鼠血漿SOD，MDA的影響表1所示，腦缺血再灌注后，模型對照組大鼠血清SOD含量明顯降低，MDA含量顯著

9、增高，與偽手術(shù)組相比差異顯著（P＜0.01或P＜0.05）。振通膠囊（0.07，0.14 g/kg）組SOD含量均較模型對照組升高（P＜0.01），而MDA含量均較模型對照組降低（P＜0.01）。表明振通膠囊有升高腦缺血再灌注損傷大鼠血清SOD含量，降低MDA含量作用。</p><p>　　表1 對腦缺血再灌注大鼠血清SOD、MDA的影響（略）</p><p>　　與模型組比較，*P＜0

10、.05，**P＜0.01</p><p>　　2.2 對腦缺血再灌注大鼠血漿NO和ET含量的影響表2所示，腦缺血再灌注后，模型對照組大鼠血液中ET含量明顯升高，NO含量顯著降低，與偽手術(shù)組相比差異顯著（P＜0.05）。振通膠囊（0.07，0.14 g/kg）均能顯著降低血液中ET含量，與模型對照組比較有顯著差異（P＜0.05）。振通膠囊（0.07，0.14 g/kg）均有升高血液中NO含量的趨勢，但與模型組比較

11、，無統(tǒng)計學(xué)意義。</p><p>　　表2 對腦缺血再灌注大鼠血漿NO和ET含量的影響（略）</p><p>　　與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；n=8</p><p>　　2.3 振通膠囊對腦缺血再灌注大鼠血漿TXB2和6-keto-PGF1α含量的影響表3所示：缺血再灌注后，模型對照組大鼠血液中6-keto-PGF1α降低，同時伴有TXB2升

12、高，與偽手術(shù)組相比差異顯著（P＜0.01或P＜0.05）。振通膠囊（0.07，0.14 g/kg）均能顯著升高6-keto-PGF1α，同時均能顯著降低TXB2；與模型對照組相比有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01），且高劑量較低劑量效果為好，但無統(tǒng)計學(xué)意義。</p><p>　　2.4 對腦缺血再灌注大鼠腦組織鈣含量的影響表5所示：缺血再灌注后，模型對照組大鼠腦組織鈣含量顯著高于偽手術(shù)組（P＜0.01）。振

13、通膠囊（0.07，0.14 g/kg）均能顯著降低腦組織鈣含量（P＜0.05或P＜0.01），且高劑量較低劑量效果為好。</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　腦缺血再灌注損傷是臨床上常見的病理現(xiàn)象,氧自由基介導(dǎo)的自由基連鎖反應(yīng)是導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷的重要原因。腦缺血再灌注中氧自由基代謝異常, 組織中氧自由基含量增多, 過多的氧自由基主要

14、作用于生物膜不飽和脂肪酸, 發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng), 造成膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞, 引起神經(jīng)元損害［1］。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物,其含量的變化間接反應(yīng)腦組織中氧自由基的變化［2］。SOD可清除超氧陰離子,使細(xì)胞免受毒性自由基的損害,其含量的變化也反應(yīng)體內(nèi)抗氧化的能力。本實驗顯示，模型組在缺血再灌注后出現(xiàn)SOD降低，MDA增高，印證了在神經(jīng)損傷中自由基的作用，而振通膠囊能通過升高SOD，降低MDA含量而

15、起保護(hù)作用。</p><p>　　表3 對腦缺血再灌注大鼠血漿TXB2和6-keto-PGF1α含量的影響（略）</p><p>　　與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；n=8</p><p>　　表4 對腦缺血再灌注大鼠腦組織鈣含量的影響（略）</p><p>　　與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;n=8&l

16、t;/p><p>　　內(nèi)皮素(ET)是一種具有強(qiáng)烈縮血管作用的血管活性肽, ET-1廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血管內(nèi)皮細(xì)胞中,與缺血性腦血管病有密切關(guān)系。實驗表明 ET-1可產(chǎn)生劑量依賴性梗死灶和周圍半暗帶的形成［3］。目前認(rèn)為,缺血性神經(jīng)元壞死的最終途徑是細(xì)胞內(nèi)鈣超載,ET-1可通過與其特異性受體結(jié)合,引起鈣內(nèi)流增加,同時激活磷脂酶C、水解磷脂酰肌醇產(chǎn)生三磷酸肌醇,促使肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載。另外ET

17、-1還可刺激興奮性氨基酸的釋放,后者與其受體結(jié)合后進(jìn)一步加重Ca2+內(nèi)流,并促使自由基產(chǎn)生和導(dǎo)致缺血性腦水腫的形成［4］。因此,腦組織中ET-1的異常表達(dá)是缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)。NO是一種血管舒張因子，與ET共同調(diào)節(jié)血管的舒縮。ET有促進(jìn)NO合成和釋放的作用，而NO抑制ET的合成。本實驗顯示，缺血再灌注后ET升高而NO降低，二者平衡破壞可能是再灌注損傷的原因，而振通膠囊能降低ET含量，減少其損害作用，而對NO作用不明顯，具體機(jī)制復(fù)雜

18、有待進(jìn)一步研究。</p><p>　　TXA2是花生四烯酸的重要代謝產(chǎn)物,它是一種強(qiáng)有力的血小板聚集物,有較強(qiáng)的促血凝作用,同時也是一種血管收縮物質(zhì)，TXB2是其穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物。在血管內(nèi)皮花生四烯酸則形成另一種強(qiáng)有力的血小板聚集抑制物PGI2, 是一種有效的擴(kuò)張血管物質(zhì), 6-Keto-PGF1α是其穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物;TXB2和6-Keto-PGF1α活性很強(qiáng),作用相反,在體內(nèi)形成一精巧的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。TXB2/6-K

19、eto-PGF1α的平衡在維持正常的血小板功能、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷有著重要的意義［5］。在腦缺血再灌注過程中,PGI2合成相對不足,TXA2產(chǎn)生過多,引起腦血管痙攣和血小板聚集及血管通透性改變,加重腦缺血和腦水腫形成,導(dǎo)致缺血后的延遲性低灌注損傷［6］。本實驗表明,腦缺血再灌注時腦組織TXB2的含量明顯升高,6-Keto-PGF1α含量明顯降低。振通膠囊能顯著提高腦缺血再灌注損傷大鼠腦6-Keto-PGF1α的含量，能顯著降低大鼠腦T

20、XB2含量，從而起到抗腦血管痙攣和改善腦血管通透性的作用。</p><p>　　腦缺血再灌注損傷中細(xì)胞內(nèi)外鈣平衡紊亂引發(fā)的神經(jīng)元損傷主要有以下幾個方面:①細(xì)胞外Ca2+大量內(nèi)流入細(xì)胞內(nèi)引發(fā)鈣超載, Ca2+ 在線粒體集聚引起水腫,ATP 合成障礙, 破壞氧化磷酸化;②激活蛋白水解酶, 使細(xì)胞骨架崩解,細(xì)胞膜損傷, 激活脂酶產(chǎn)生毒性自由基, 攻擊細(xì)胞膜;③核內(nèi)集聚, 激活核酶使DNA 斷裂, 染色體聚集、固縮;④在

21、高爾基器內(nèi)集聚引起水腫; 最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死［7,8］。本實驗顯示，腦缺血再灌注損傷后腦組織鈣含量升高，而振通膠囊能降低腦組織鈣含量，且呈劑量依賴，說明它通過某種機(jī)制幫助恢復(fù)鈣的平衡，減輕組織損害，具體機(jī)制既與上述對抗過氧化損傷、降低ET的損害作用、調(diào)節(jié)腦血管有關(guān)，又有更為復(fù)雜的機(jī)制。</p><p>　　綜上所述，通過研究振通膠囊對腦缺血再灌注損傷作用，揭示了它對中風(fēng)后遺癥的治療作用可能是通過對自由基、血栓

22、素、內(nèi)皮素及鈣離子的影響起作用。</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　?。?］ T raystman RJ , Kisch JR, Koeh ler RC. Oxygen radical mechanism of brain injury following ischemia and reperfusion［J］.J Applied P

23、hysiology, 1991, 71: 1185.</p><p>　?。?］ Imazumi S, Tominage T, U enohara H, et al. Initiation and propagation of lipid peroxidation in cerebral infarction models［J］.Neuro Res, 1986, 8: 214.</p><p&

24、gt;　?。?］ FuxeK, CintraA, AndbjerB, etal. Centrally administered en-dothelin-1 produces lesions in the brain of the male rat［J］.Acta Physiol Scand,1989,137:155.</p><p>　　［4］ Chuang DM,Lin WW,Lee CY.Endothelin

25、-induced activation of phosphoinositide turnover, calcium mobilization, and transmitter release in cultured neurons and neurally related cell types［J］.JCardiovasPhamacol,1991,17(supp17):85.</p><p>　　［5］ 駱麗娟，

26、顧仁樾.冠心病證型與p-選擇素、TXB2和6-Keto-PGF1α含量關(guān)系研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志,2002,(7):13.</p><p>　　［6］ Naclman RL.Thrombosis and atherogenesis:Molecularconnections.Blood,1992,79:897.</p><p>　?。?］ SchlaepferWW , HaslerMB.

27、 Charaterization of the calcium induced disruption of neuro filaments in rat peripheral nerve［J］.Brain Res, 1979, 168: 299.</p><p>　?。?］ Cheung JY, Bonventre JV , Malis CD, et al. Calcium and is chemic injur