海洋細菌分布特征、影響因素及計數方法研究【文獻綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　海洋細菌分布特征、影響因素及計數方法研究</p><p>　　摘要: 海洋是一個特殊環(huán)境，其所含細菌不同于陸地，特別是近年來人們對海洋細菌研究工作的日益重視，不斷發(fā)現了一些新的海洋細菌，并探索環(huán)境條件等

2、對海洋細菌生長的影響，以及一些先進的浮游細菌計數方法。 這對人們了解海洋細菌及日后開展細菌的檢測將提供有力保障。近幾年，隨著人們對生存空間的關注、對生活質量的保障，人們對海洋資源越來越關注，對海洋微生物的研究工作越來越受到重視，現將海洋細菌學方面的相關研究進展做一綜述。</p><p>　　關鍵詞：海洋；浮游細菌；環(huán)境因素；計數方法；</p><p>　　海洋環(huán)境中的細菌是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的

3、一個重要組成部分，它們在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)、能量流動、元素轉化、生態(tài)平衡及環(huán)境凈化等方面起著舉足輕重的作用。海洋浮游細菌(marine bacterioplankton)主要包括異養(yǎng)細(heterotrophic bacteria)和超微型光合原核生物(picoprokaryotes)藍細菌(Synechococcus，聚球菌屬，細胞粒徑為 0.5-1.5μm)及原綠球藻(Prochlorococcus，細胞粒徑為0.4-0.8μm

4、)，在全球碳循環(huán)中非常重要，已經成為生物學和生態(tài)學研究中的前沿領域之一。</p><p><b>　　1 海洋細菌分布</b></p><p>　　海洋細菌垂直分布的一般規(guī)律是由表面向下逐漸減少。但在溫帶和亞熱帶海區(qū)其密度的最大值是處于溫躍層(冷暖水層交界處)，因為那里有豐富的生物及微生物遺體并有較高濃度的有機懸浮顆粒能被微生物所利用。其在海洋中的水平分布，受大陸架的

5、強烈影響，在任何情況下近陸水域中的浮游細菌都比大洋水中為多。海洋細菌分布的另一特點是單個浮游的少，大部分是附著在懸浮的有機顆粒、浮游生物的體表及海產動植物體上，尤其在海產動物的消化道中有更多的微生物集聚。</p><p>　　2 海洋細菌的生理生化特性</p><p>　　遠海與近海因生態(tài)環(huán)境有差異及受生活用水污染的程度不同同樣的海深(垂直深度相等)可有不同的海洋細菌。另外，隨著海浪海涌的

6、活動和日照對海平面的溫度效應, 不同的海深(垂直深度不等)也會有不同的海洋微生物。</p><p>　　海洋細菌不同于陸地細菌，這是由于它的特殊性質所決定。</p><p>　　喉冷性是海洋細菌主要生理特性之一。生活在海洋中的細菌大都適于在較低溫度下增殖的特性，而對高溫的感受性化較敏感。Morita多年來對海洋的喉冷菌作了調查研究，認為絕大多數海洋細菌的最適生長溫度為10~25℃, 但有很

7、多種類能在0℃時發(fā)育良好, 故有中溫細菌及低溫細菌之分。</p><p>　　海洋細菌都有嗜鹽的特性,海洋鹽的含量平均為3.5% ，鹽份中氯化鈉含量為77.8%，故大多數海洋細菌是嗜鹽性的，它們在鹽濃度2.5% ~ 4% 時生長良好。Larsen 按嗜鹽程度不同把海洋菌分為低嗜鹽(含鹽2% ~ 5%)，等嗜鹽(5% ~ 20%)，高嗜鹽(20% ~30% )，還有一些耐鹽菌，主要在近海岸處發(fā)現[1] 。</

8、p><p>　　嗜壓性和耐壓性也是海洋細菌的生理特征之一，特別是深海來源的菌株必須在高壓下生長，故有喉壓菌之稱。Kriss曾經將4560米水深的菌株分別培養(yǎng)在常壓和5000大氣壓下，培養(yǎng)72小時后測定對葡萄糖的發(fā)酵力，結果發(fā)現后者比前者的發(fā)酵力超出70%以上。ZoBell研究了淺海菌株與陸生菌株都有相擬的耐壓性，在200~400大氣壓下均被抑制, 在500~600大氣壓下則均死亡，所謂一些喉壓菌大都是來自水深1000

9、米以下的水中。</p><p>　　3 海洋細菌的影響因素</p><p>　　海水中細菌數量的影響因素很多，可歸納為以下兩大類：一、非生物因素：包括光、溫度、海流、水團、底質、各種有機和無機的溶解物質和懸浮物質等等。</p><p>　　它們對海洋生物的分布、生長、繁殖等方面有 重要的影響。二、生物因素：生物周圍的同種和異種的其他生物，各種生物互為環(huán)境中的生物因素

10、。主要是營養(yǎng)、競爭、共生等關系[2]。種類的個體間相互聯系和相互影響決定著一個種的種群結構、地盤及其資源利用的方法以集中的生活方式和繁殖[3]等。海水中的細菌數量的變化范圍一般在 103-106個/ml，最高值常常出現在營養(yǎng)物質豐富的靠近海岸的地方。除了溫度變化會影響細菌的數量以外，生態(tài)系統(tǒng)中的營養(yǎng)物質的存在情況、浮游生物的作用、海水的物理化學變化也會對浮游細菌產生重大影響。</p><p>　　3.1溫度對浮游

11、細菌分布的影響</p><p>　　海水溫度直接影響海洋浮游細菌的代謝，對海洋細菌種群具有強烈的選擇作</p><p>　　用。隨著海水溫度的季節(jié)變化，細菌數量也出現季節(jié)分布，細菌數量的最高值和</p><p>　　最低值分別出現在夏季和冬季。水溫同時顯著影響海區(qū)的初級生產力，導致海區(qū)</p><p>　　DOM 含量發(fā)生改變，從而對細菌生產

12、力產生間接影響。Wright and Coffin[4]認為溫度的作用是影響其他因素來決定浮游細菌的分布，這些因素是休眠、底質供應和捕食。</p><p>　　3.2營養(yǎng)鹽對異養(yǎng)浮游細菌生產力的影響</p><p>　　海洋細菌可利用溶解性的無機氮(DIN)和溶解性的無機磷(DIP)作為 N 和 P 源[5-6]。Brett[7]等研究認為在湖泊中浮游細菌和浮游植物的生長受同樣的營養(yǎng)鹽限制

13、，尤其是無機氮、磷。在海洋真光層中，不單單是浮游植物吸收銨鹽(NH4+)，同樣異養(yǎng)細菌也吸收利用了很大部分銨鹽[5,8]。</p><p>　　3.3浮游生物與海洋細菌的密切聯系</p><p>　　細菌與浮游植物之間的關系是相當密切的[9]。許多學者的研究[10-15]表明，浮游植物的數量與細菌數有關，浮游植物的旺盛通常伴隨著浮游細菌的豐度、生產力、胞外酶及區(qū)系組成的顯著變化。細菌能夠吸

14、收浮游植物所產生的有機物質，促進自身的生長，同時為浮游植物的生長提供必要的有機營養(yǎng)和生長因子，并調節(jié)浮游植物的微生長環(huán)境。另外，細菌可以通過參與生物競爭、分泌特殊物質等途徑抑制浮游植物的細胞生長，甚至裂解其細胞[16]。</p><p><b>　　4 細菌計數方法</b></p><p>　　估算細菌的數量和生物量對于研究生源要素在海洋地球化學過程中的變化規(guī)律是十分

15、重要的。長期以來，人們多用涂布平板培養(yǎng)法(PC)和最大或然數法(MPN)來測定樣品中的活細菌數。但是由于受到培養(yǎng)基中營養(yǎng)物種類、濃度及培養(yǎng)條件等限制，大多數在顯微鏡下觀察到的細菌不能在同一培養(yǎng)基上生長、繁殖而達到肉眼可見；海水中還有一些是不可培養(yǎng)細菌,致使自然樣品中所得活細菌計數值偏低[17]。自從熒光顯微計數法應用于微生物生態(tài)學研究領域，對于環(huán)境中細菌總數及活細菌數測定的準確性有了很大提高。</p><p>　

16、　4.1染色直接計數法</p><p>　　直接計數法計算細菌數量(direct count)，即通過顯微鏡直接觀察計數，由于不需要培養(yǎng)，一般能比間接計數法如平板計數法(plate count)計算的細菌數量高1 ～ 3 個數量級[18]?；诖?，直接計數法逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)的間接計數法，成為一種新的通用的細菌總數計數法。吖啶橙和DAPI是2 種常用于直接計數法的熒光染料。</p><p>　　

17、4.1.1吖啶橙染色直接計數法</p><p>　　Fransisco等最早應用該方法計數自然水體中的細菌總數，從而確定了該方法的基本程序。后經Zimmermann和Meyer-Reil、Daley以及Hobbie等的修改而成為目前較為通用的吖啶橙染色直接計數法(AODC)。</p><p>　　吖啶橙是一種熒光染料，它和細菌接觸以后，可以和細胞中的核酸物質特異結合,然后在激發(fā)光的激發(fā)下產

18、生綠色或紅色的熒光。細菌產生的熒光顏色因其生理狀態(tài)的不同而改變。處于靜止期或不活動狀態(tài)時將是綠色熒光，因為它們的核酸主要是雙螺旋DNA。而死細菌細胞中的DNA則被破壞成單螺旋DNA，它與吖啶橙反應呈現紅色的熒光。但在培養(yǎng)過程中,處于高速率生長的細菌細胞中，由于其RNA占優(yōu)勢，因此也成紅色熒光。大多數自然界出現的細菌是綠色熒光，表明它們是活菌但生長非常緩慢。當紅色與綠色熒光混合在一起時，眼睛看到的是黃色熒光。</p><

19、;p>　　其步驟是取一定濃度的吖啶橙溶液對一定量的樣品進行染色以后，在負壓狀態(tài)下把樣品過濾到無自發(fā)熒光的黑色濾膜上，沖洗后將濾膜置于載玻片上，滴上一滴無熒光的香柏油，蓋上蓋玻片，然后置于落射熒光顯微鏡(100倍油鏡)下觀察并計數有細菌形態(tài)、呈現亮綠色或紅色熒光的細菌數,最后換算成單位樣品中細菌數。這種計數方法，既簡單方便，又快速準確，節(jié)約了很多時間，適合用于測定水環(huán)境細菌總數。它的不足在于非細菌熒光顆粒對計數有干擾,細菌在濾膜表面

20、的分散情況、染色步驟、樣品過濾體積的差異、不同的熒光顯微鏡以及研究者的主觀因素等均可造成計數偏差。盡管存在不足之處，AODC法仍廣泛應用于各種水環(huán)境細菌總數的測定，國家技術監(jiān)督局已將AODC法作為海洋細菌總數的計數方法列入國家標準。</p><p>　　4.1.2DAPI 染色計數法</p><p>　　相對于吖啶橙計數法不易區(qū)分出細菌和黏土、膠體、碎石等非生命的顆粒物，具有更好特異性的

21、DAPI 能與細菌 DNA結合時發(fā)藍光，結合到無DNA 的物質時發(fā)出淡黃光，因此 DAPI 熒光染色計數法更適合于沉積物環(huán)境的計數[19]。然而，環(huán)境中仍有一些非生命物質能被 DAPI 染色劑所染色而造成細菌計數的誤差。沉積物的復雜環(huán)境加劇這類非特定性染色所造成的細菌計數誤差[20-21]。首先是沉積物的質地不均一影響計數效果，細菌容易附著在沉積物中而不易分散，因此需要通過稀釋、超聲實驗將沉積物均質化，并將細菌從沉積物中分離。其次，DA

22、PI 操作步驟影響染色效果，包括 DAPI 染色劑的濃度和染色時間。染色不充分會低估細菌的數量，而過量的染色將使背景色過高而造成計數不便[22]。第三是細菌和雜質的含量也會影響計數效果，一些形態(tài)大小與細菌相似的無機質和有機質會影響 DAPI 正確染色效果[23-24]，而Zweifel 等[18]在傳統(tǒng)的 DAPI 染色步驟的基礎上加了異丙醇褪色步驟，把加入褪色步驟計算出的細菌數量(nucleoid-containing cells，N

23、UCCs)視為有明顯代謝活性的細菌</p><p>　　具有感潮性質的河段是河流和海洋的過渡地帶，由于潮汐的漲落使物質的傳輸不僅存在著水平運動，也存在著垂直混合運動，因此它對物質的分布具有重要影響[29]，其理化環(huán)境的復雜性也使其具有比普通河流及海洋更復雜的生物環(huán)境[30]。本實驗以具有感潮特性的珠江廣州河段為研究對象，該河段長期受工業(yè)和生活的雙重污染，因此它兼有河口和城市河流的特點。本研究將分析這一河段中有機質

24、、粒徑組成等對DAPI 染色計數法染色效果的影響，以期為下一步測定分析珠江廣州河段沉積物中細菌種類和活性的垂向分布提供依據。</p><p>　　DAPI染色實驗包括DAPI濃度及染色時間。在DAPI濃度為 5μg·mL-1時，細菌顯色不清晰，細菌數量偏少；DAPI濃度為10μg·mL-1時，細菌與背景色能較好分辨；DAPI濃度為15μg·mL-1時，大量雜質被染色，造成細菌計數困難

25、。染色時間對DAPI計數法效果影響不大，染色30 min 以上足以達到要求。DAPI染色劑的濃度決定染色細菌的清晰程度及雜質被染色的程度。盡管Schallenberg 等[31]指出5μg·mL-1的 DAPI濃度能適應含水率含量為 64% ～99% 的沉積物的細菌染色，但由于沉積物質地和細菌數量的不同，因此最佳 DAPI濃度也有所改變。</p><p>　　4.2活菌直接計數法(DVC)</p&

26、gt;<p>　　Kogure等將熒光顯微技術與培養(yǎng)法結合起來,設計出了活菌直接計數法(DVC)。這種方法可以在顯微鏡下直接計數活的海洋細菌。這種方法包括兩個步驟。第一步是向海水水樣中加入微量的酵母膏及萘啶酮酸(Nalidixic acid)后，進行一段時間的預培養(yǎng)。萘啶酮酸是一種特殊的DNA合成抑制劑，它可以阻礙革蘭氏陰性細菌的細胞分裂，而其它合成作用代謝途徑則照常進行，這就導致形成大型絲狀細胞，而這些增大了的細胞，在顯

27、微鏡下是比較容易計數的。第二步，經過預培養(yǎng)的水樣中的細菌再用吖啶橙染色，然后在落射熒光顯微鏡下觀察計數。視野中伸長、變粗、發(fā)橙紅色熒光的菌體被認為是活菌。</p><p>　　DVC與AODC染色法相比,這種方法受染料干擾比較小,背景更清晰,使染色的效果更加專一,應用也比較廣泛,但適合用于水環(huán)境中活細菌的計數。</p><p>　　4.3免疫熒光顯微鏡法</p><p&

28、gt;　　1979年Stanley等首先使用了免疫熒光顯微鏡法直接測定細菌的數量。這種方法是利用抗原和抗體相互作用的原理及熒光物質(如FITC)與微生物細胞相互作用，通過對顯微鏡視野下進行熒光數量的測定就可得到樣品中細菌數量。但是這種方法受到細菌本身抗原是否表達的限制(即細菌需要在一定的條件下才能表達抗原)[32]；同時抗體的專一性比較強，自然水樣中細菌并不是都能與之相結合，故其不太適合測定自然水樣(含有多個細菌菌群)中細菌的總數。&l

29、t;/p><p>　　熒光顯微計數法在海洋微生物資源調查中的應用，大大提高了海洋細菌監(jiān)測結果的準確性,減少了監(jiān)測過程中的大量勞動，縮短了監(jiān)測時間，促進了人們對海洋資源的進一步認識和利用。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 郁慶福. 衛(wèi)生微生物學[M] . 第2 版. 北京: 人民出版社, 1992. 13.1

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