腫瘤標志物檢測的質(zhì)量保證

1、<p>　　腫瘤標志物檢測的質(zhì)量保證</p><p>　　一、腫瘤標志物的定義  </p><p>　　腫瘤標志物（tumor marker，TM）是指在腫瘤的發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身所產(chǎn)生的或者是由機體對腫瘤細胞反應而產(chǎn)生的，反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、激素、酶（同工酶）、多胺及癌基因產(chǎn)物等。腫瘤患者血液或體液中腫瘤標志物的檢測，對腫瘤的輔助診斷

2、、鑒別診斷、療效觀察、病情監(jiān)測以及預后的評價具有一定的價值。</p><p>　　腫瘤標志物存在于細胞漿和細胞核中，與細胞表面膜相連，在血液中進行循環(huán)。腫瘤標志物可以在血清、血漿、其他體液、組織提取物或石蠟固定的組織中檢測到。大多數(shù)腫瘤標志物可以用免疫學的技術進行檢測。 </p><p>　　二、影響腫瘤標志物檢測的因素</p><p>　　1.樣本采集對檢測的影響

3、 </p><p>　　如前列腺按摩、前列腺穿刺、射精、導尿和直腸鏡檢查后，血液PSA和PAP值可升高；肝、腎功能異常和膽道排泄不暢、膽汁淤滯等均可造成腫瘤標志物如 CEA、ALP、GGT、細胞因子等濃度增高；某些藥物影響腫瘤標志物的濃度，如抗雄激素治療前列腺癌時可抑制PSA產(chǎn)生，導致 PSA 假陰性結(jié)果；唾液和汗液污染標本可使SCC升高。由于紅細胞和血小板中也存在神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE），因此，樣本溶血或

4、放置時間過長（且未分離血清保存）可使血液中NSE濃度增高。采血管內(nèi)的促凝劑或抗凝劑，對某些項目的測定有干擾。</p><p>　　2.樣本保存對檢測的影響</p><p>　　血液標本采集后應及時離心,分離血清或血漿盡快測定,或保存于4℃冰箱中；若在2～3個月內(nèi)測定,則應低溫冰凍保存,防止反復凍融。酶類和激素類TM不穩(wěn)定,如fPSA和HCG,半壽期短,易降解,應及時測定。</p>

5、;<p>　　3.腫瘤病人自身狀況的影響 </p><p>　　腫瘤患者自身的狀況影響腫瘤標志物的檢出及血液中腫瘤標志物的濃度，包括：①腫瘤的大小和腫瘤細胞的數(shù)目：腫瘤越大、腫瘤細胞的數(shù)目越多，血液中TM越高。②腫瘤細胞自身的分化程度：腫瘤細胞的分化程度越差，惡性程度越高，血液中TM越高。③腫瘤的分期不同：腫瘤越晚期，血液中TM越高。④腫瘤細胞表達和合成腫瘤標志物的程度：腫瘤細胞表達和合成的TM程度

6、越高，血液中TM越高，反之，血液中TM較低。⑤腫瘤細胞的壞死和壞死程度：腫瘤細胞壞死后，釋放出TM，使血液中TM升高，壞死程度越大，血液中TM升高越明顯。⑥TM在體內(nèi)的降解和排泄：若肝臟、腎臟功能差，排泄速度慢，則TM在體內(nèi)明顯升高。⑦假陽性和假陰性；有些疾病如炎性疾病，結(jié)締組織病和生理變化如妊娠時，有些標志物的表達也升高，可導致假陽性；而有些腫瘤標志物較少或腫瘤細胞被封閉，抗原抗體形成免疫復合物，血循環(huán)差等都可導致腫瘤標志物不能被檢出

7、，導致假陰性。⑧生物學因素的影響: 隨年齡的增長PSA升高;老年人CA199、CA153、CEA等可升高。部分婦女在月經(jīng)期CA125和CA199可增高，妊娠期血液中AFP和CA125含量明顯升高；長期吸煙會使血液中CEA含</p><p>　　因此，腫瘤患者的腫瘤標志物基礎測定值對于觀察療效、預測復發(fā)有非常重要價值。對腫瘤標志物檢測正常的腫瘤患者，還可以做如下解釋：療效顯著、未復發(fā)未轉(zhuǎn)移；未選擇到恰當?shù)哪[瘤標志物

8、，提供錯誤信息；是一種目前還未發(fā)現(xiàn)的腫瘤細胞亞型。 </p><p>　　三、腫瘤標志物檢測的質(zhì)量保證</p><p>　　（一）腫瘤標志物檢測前的要求</p><p>　　對病人的信息進行充分了解，確保實驗結(jié)果的準確性。</p><p>　　檢測前樣本的保存：血液標本采集后應及時離心，保存于4℃冰箱中，24小時內(nèi)測定；如在短期內(nèi)測定，則應-

9、20℃保存，長期保存應置于-70℃ 冰箱, 標本應防止反復凍融。酶類和激素類腫瘤標志物不穩(wěn)定，易降解，應及時測定或低溫保存。 </p><p>　?。ǘ┠[瘤標志物分析檢測的要求 </p><p>　　滿意的測試結(jié)果來自于符合要求的標本以及經(jīng)過室內(nèi)質(zhì)控（IQC）和實驗室間質(zhì)量評價（EQA）監(jiān)測評價的有效的實驗方法。室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評的監(jiān)測評價包括實驗的重復性、采用的標準、所用基質(zhì)的影響、動

10、力學范圍、參考品、穩(wěn)定性、分析結(jié)果的理論數(shù)據(jù)、實驗方法。</p><p>　　腫瘤標志物測定方法很多，有放射免疫測定法，酶聯(lián)免疫測定法，化學發(fā)光免疫測定法等，每種測定方法有自己的精密度和重復性，但手工操作的方法重復性較差，誤差比較大，操作時要特別認真；用自動化儀器進行測定，重復性好，誤差小，實驗結(jié)果的分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)可以達到<5%和<10%，具有手工分析難以比擬的優(yōu)勢。各實驗室還應注意影響實驗特

11、異性的因素。</p><p>　　不同的試劑盒測定也有差異,其原因是由于使用的單克隆抗體針對抗原的位點不同所致。有時即使使用同一抗體，也可能因抗原異質(zhì)性（如原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移后，失去了原有的抗原性而停止分泌原有的腫瘤抗原）或基質(zhì)的影響而得到不同的結(jié)果。有研究報道，使用12種不同的CEA試劑盒檢測某一混合血清中CEA的濃度，結(jié)果其差異超過100%。導致分析間誤差的主要原因是沒有測定的標準化，包括缺乏統(tǒng)一的抗原、抗原成分、

12、校正品和參考方法等。因此，在工作中要盡量使用同一種方法，同一種儀器和同一廠家的試劑盒進行測定。</p><p>　　1.室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）的要求</p><p>　　腫瘤標志物很少有參考方法，要堅持作室內(nèi)質(zhì)控圖，以均值為靶值，來判斷試驗的穩(wěn)定性和重復性。 </p><p>　?、僦貜托裕豪硐氲姆治雠鷥?nèi)誤差應<5%；批間誤差<10%。</p>

13、;<p>　　②建立測定認可的標準：選擇合適的IQC標準。</p><p>　?、蹣悠放c病人血清盡可能相似：僅僅采用試劑盒所附的質(zhì)控品是不夠的，還應包括獨立來源的可靠的血清基質(zhì)質(zhì)控品。 </p><p>　?、躀QC樣品的濃度適合臨床應用：應包括腫瘤標志物的陰性和低值陽性質(zhì)控品，需要較寬的濃度范圍；評價高濃度樣本稀釋后的測定準確度。</p><p>　

14、?、菰u價實驗的干擾因素：要求對實驗的干擾因素（嗜異性和其他抗體、血凝試管中的凝血試劑等）進行檢查。</p><p>　　2. 實驗室間質(zhì)量評價（EQA）的要求</p><p>　?、龠m宜濃度的EQA樣本：EQA樣本應具有適宜的工作濃度范圍，但有時會需要較高濃度的EQA樣本來評價實驗的稀釋步驟。對于某些分析（如：AFP、hCG）用無分析物血清檢查基線的可靠性是很重要的。 </p>

15、<p>　　②實驗“穩(wěn)定性”的評價：在一定時間內(nèi)（6-12個月）重復進行相同樣本的測試，對實驗室內(nèi)實驗結(jié)果的重復性進行評價。 </p><p>　?、垓炞C靶值的精確度和穩(wěn)定性：指無現(xiàn)成參考方法時，需要對所使用的方法進行以下驗證：穩(wěn)定性：對同一樣本進行重復測定；用已知濃度的相關國際標準品進行回收率實驗；對不同實驗室間的檢測結(jié)果（參考值范圍、結(jié)果累計報告等）進行比較。 </p><p

16、>　　3.腫瘤標志物測定的標準化問題 </p><p>　　要保證TM檢測結(jié)果的準確性和各實驗室之間的可比性,首先診斷產(chǎn)品要達到國際標準(IS),有統(tǒng)一的參考方法和國際參考品(IRR)。但目前尚無公認的參考方法,能得到的國際標準品僅有AFP、CEA、HCG和PSA四種,而CA系列的TM至今還沒有國際標準,這為TM測定的準確性和質(zhì)量控制帶來了困難。</p><p>　　涉及到免疫測定標

17、準化的組織有世界衛(wèi)生組織（WHO）生物學標準化專家委員會（The Expert Committee on Biological Standardization，ECBS），負責建立生物物質(zhì)的國際標準及參比材料。 WHO通過國家生物學標準和質(zhì)控物研究所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSCC）提供大多數(shù)多肽激素和一些腫瘤標志物的國際標準品。一些地區(qū)性組織

18、也制備標準品，如美國的疾病控制中心（Centers of Disease Control，CDC）、美國病理學家協(xié)會的國家委員會（National Committee of the College of American Pathologists）、國家衛(wèi)生研究所（National Institute of Health，NIH）等提供用于研究目的的多肽激素標準品。國際癌癥生物學和醫(yī)學學會（ International Society

19、of Onco-developmental Biology and Medicine ）已啟動一個腫瘤標</p><p>　　4.抗原、抗體和基質(zhì)效應對腫瘤標志物測定的影響</p><p>　　抗原抗體反應是指抗原與相應抗體間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應,受抗原抗體的性質(zhì)、活性、效價、反應比例及環(huán)境(如電解質(zhì),pH 值,溫度)等因素影響。在TM測定中應注意:①確認樣品中被檢抗原和校準品中抗原的一

20、致性。②制備抗體時使用的抗原和樣品中抗原的一致性。③抗原過剩的識別。④試劑使用的是多克隆抗體，則抗體的純度很重要；試劑使用的是混合單克隆抗體則每批抗血清內(nèi)各單克隆抗體的組成及相對比例很重要，并要保持恒定。另外，很多腫瘤標志物是糖蛋白或粘蛋白，糖基化的不均一性可能導致其免疫反應性某些變化，從而引起測定結(jié)果的差異。⑤校準品穩(wěn)定、無混濁。⑥抗原抗體反應時所處的基體（基質(zhì)）狀況應保持恒定和一致。 </p><p>　　免

21、疫反應的基質(zhì)效應是指干擾抗原、抗體反應而與分析物本身無關的所有非特異性因素(即基質(zhì))對分析物反應的影響?；|(zhì)效應通常由蛋白質(zhì)、電解質(zhì)、補體、類風濕因子、抗人球蛋白抗體、藥物、添加劑和各種污染物引起。標準品和質(zhì)控品的基質(zhì)與待測血清標本不一樣,標準品的基質(zhì)通常是含蛋白的緩沖溶液；標準品和質(zhì)控品都是經(jīng)過加工處理的,如冰凍、冷凍干燥、加穩(wěn)定劑或添加某些分析物等,而臨檢所用的測定方法、儀器、試劑等都是以人新鮮血清標本為模板的,對血清標本測定有可靠

22、性,而對加工處理過的物質(zhì)不一定可靠。對于基質(zhì)效應，需要注意以下幾點：①同一基質(zhì)狀態(tài)的基質(zhì)效應隨方法及檢測條件而異。 ②基質(zhì)效應是絕對的，只要處理過的樣品和測定樣品的基質(zhì)狀態(tài)不一，一定有基質(zhì)效應；基質(zhì)效應又是相對的，只要認可某一方法的基質(zhì)效應可忽略不計，或者由基質(zhì)效應對某方法引入的誤差在可接受水平，那么衡量另一方法是否具有基質(zhì)效應時，應作方法學比較。若處理過的樣品和測定樣品的結(jié)果分布不同，說明基質(zhì)效應明顯。反之屬可接受。也即認為“無” 基

23、質(zhì)效應。③嚴格講，不同批號試劑，它們產(chǎn)生的基質(zhì)效應也不一致。度量有無基質(zhì)效應，或者了解不同方法間的可比性，最佳樣品是人</p><p>　　5.引起腫瘤標志檢測錯誤結(jié)果的潛在因素 </p><p>　?、俑邼舛萮ook效應：通常情況下，腫瘤標志物的濃度范圍會有好幾個數(shù)量級的差別，因此有可能需要確認高濃度的樣本產(chǎn)生的hook效應，以避免低值結(jié)果的錯誤報告。這對于首次進行腫瘤標志物檢測的病人猶

24、為重要。（可以通過使用高結(jié)合力的固相抗體、分析兩個稀釋度的樣本、或通過后續(xù)的分析步驟包括清洗步驟來減少hook效應。） </p><p>　?、跇颖鹃g的攜帶：檢測高濃度的樣本會產(chǎn)生樣本間攜帶的潛在問題，因此有必要對此進行隨時檢查。 </p><p>　?、凼犬愋曰蛉丝故罂贵w（HAMA）的干擾：IgG抗體可以和測定中使用的抗體進行反應。通常情況下，由于進行影像檢查和治療而使病人接觸鼠單克隆抗

25、體，由此而產(chǎn)生的人抗鼠抗體會使腫瘤標志物的檢測出現(xiàn)錯誤結(jié)果。（可以通過使用阻斷劑對樣本進行前處理、在反應基質(zhì)中加入非免疫的鼠血清或?qū)颖具M行稀釋后再進行分析的方法來減少HAMA的干擾。）</p><p>　?。ㄈ┠[瘤標志物分析檢測后的要求</p><p>　?、偻ㄟ^詢問醫(yī)生獲取病人的臨床信息：有必要鼓勵臨床醫(yī)生提供帶有說明的簡短的臨床信息（如手術后、化療后等），這有助于確認偶然誤差（如可

26、能出現(xiàn)的儀器上加錯標本等）。另外，當改變TM 檢測方法和試劑時,必須通知臨床,避免對結(jié)果的誤判。實驗室還應印發(fā)宣傳資料介紹TM標本采集的注意事項,并提出TM 檢測的合適頻率供臨床參考。這些措施對提高檢測質(zhì)量,用好TM非常有用。</p><p>　　②參考值范圍的有效性：通常來自相應的健康人群的參考值范圍與初始治療前的腫瘤病人有很好的相關性。因此，病人自己的“基線”值對于腫瘤標志物的測定結(jié)果具有非常重要的參考意義。

27、只有基于有效的參考范圍，增高甚至在參考范圍增高才有臨床顯著床意義，但須進行進一步的工作。 </p><p>　　③了解顯著變化或臨床相關變化的組成因素：應包括生物學變異和分析數(shù)據(jù)的變異。一般病人的結(jié)果在排除檢測方法引起的誤差后，上升或下降25％都有臨床價值。對于測定結(jié)果升高的標本必須復查，以防測定誤差。 </p><p>　　④改變方法時應進行方案確認：有助于確認由于改變方法而引起的腫瘤標

28、志物檢測結(jié)果的差異。（可能需要對以前檢測過的樣本再用新的方法進行檢測來確認結(jié)果的差異。） </p><p>　?、荼仨氈滥[瘤標志物的半壽期：TM的半壽期是指腫瘤組織被完全切除后血液循環(huán)中TM濃度下降到50%的時間。這有助于選擇TM的監(jiān)測時間和解釋TM濃度變化與臨床療效和腫瘤復發(fā)的關系。若復查間隔時間太短,將誤認為腫瘤未被完全切除；間隔時間太長,將無法區(qū)分是腫瘤復發(fā)還是療效欠佳。一般應在治療結(jié)束后5個半壽期采血為

29、好,這時原有的TM約97%已被清除。主要TM的生物半壽期: CA199為4～8天；CA153為5～7天；CA125為5天；CA724為3～7天；細胞角質(zhì)蛋白19片段(CYFRA21)為1天；AFP2～8天；CEA2～8天；PSA2～3天；fPSA12～18小時；HCG12～36小時；NSE 1天；SCC1天。</p><p>　?、弈[瘤標志物臨床應用的比較：首先需要得到有關腫瘤標志物臨床應用的信息，再由有關的專業(yè)

30、組織進行考察比較。</p><p>　　六、常用腫瘤標志物檢測中的注意事項</p><p><b>　　CA15-3</b></p><p>　　分析測試前準備和樣本貯存：進行CA15-3的檢測可以采用新鮮分離的血清樣本。CA15-3在4℃下可以穩(wěn)定24小時。建議將血清貯存于-20℃（短期）或-70℃（長期），以備復試時使用。若需長期貯存，則不

31、能使用變性膠（CA15-3在變性膠的存在下表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定）。 </p><p>　　分析中的注意事項：每個實驗室都應對CA15-3的分析方法、分析精密度和參考值范圍進行驗證，以確定臨床診斷的界限值。 </p><p>　　分析后結(jié)果報告的注意事項：應進行進一步的研究來確認性別、種族、年齡和絕經(jīng)情況對正常人和乳腺癌病人CA-153表達的影響，制訂出腫瘤標志物的參考值范圍。</p&g

32、t;<p><b>　　CA125</b></p><p>　　分析前注意事項：含糖的血清腫瘤標志物一般在常規(guī)實驗室室溫條件下有一定程度的穩(wěn)定性。然而樣本的快速處理對于減少分解是十分必要的。新鮮分離的血清應該立即進行CA125的測定。血清樣本應于4℃下存放或凍存于-20℃（短期）或-70℃（長期），以備復試時使用。 </p><p>　　分析中的注意事項

33、：NACB認為，CA125的測定結(jié)果用于病情監(jiān)測，CV值應<15%。在此CV值下，95%可信限的范圍是21～39U/ml，平均30U/ml。EGTM建議，腫瘤標志物自動化測定的批內(nèi)變異應<10%，并應考慮生物變異和分析的不精確度。 </p><p>　　分析后結(jié)果報告的注意事項：由于各廠家的檢測試劑盒檢測結(jié)果略有不同，因此應在報告中附加試劑盒標明的正常值范圍。 </p><p>

34、;<b>　　SCCA</b></p><p>　　分析前注意事項：由于唾液、汗液和呼吸分泌物中存在大量SCCA，因此血樣應避免暴露于皮膚和唾液。 </p><p>　　分析中的注意事項：SCCA測定的平均日間變異為24%，因此在監(jiān)測疾病復發(fā)時，應分別考慮其Cut-off值。 </p><p>　　分析后結(jié)果報告注意事項：應同時報告試劑盒生產(chǎn)廠

35、家標明的正常值范圍。</p><p><b>　　PSA</b></p><p>　　分析前注意事項：NACB對用于PSA測定的標本的采集和處理作出如下建議：因為有許多因素都會影響PSA的含量，所以應確保在任何有關前列腺的活動之前進行血樣的抽取，也就是說，在射精后至少24小時（如果在24小時以內(nèi)，應注意最后一次射精的時間）、前列腺炎癥消退、前列腺活檢、經(jīng)尿道的前列腺切

36、除后數(shù)周再進行游離PSA的檢測。由靜脈抽取的血樣應在3小時內(nèi)離心分離出血清。血清樣本在冰箱中可保存24小時以上，但應于24小時內(nèi)進行測定，否則就應將樣本凍存于-20℃以下（最好在-30℃以下避免結(jié)晶），長期保存溫度應在-70℃以下?？紤]到以上對樣本的要求在日常工作中可能較難達到，EGTM建議根據(jù)采集樣本時病人的情況而使用特定的分析參考值。 </p><p>　　分析和結(jié)果報告注意事項：結(jié)果報告中應注明，單次PSA

37、的檢測結(jié)果不能用于前列腺癌的診斷和判定，應該和物理檢查結(jié)合使用。結(jié)果報告中還應分別注明分析實驗的靈敏度和正常值參考范圍，并說明結(jié)果不能用作評判惡性腫瘤是否存在的證據(jù)，除非有另外一些檢測結(jié)果說明一定程度上升高的PSA水平不是由于良性前列腺組織疾病所引起的。報告中還應注明PSA分析（試劑、儀器）的生產(chǎn)商，并聲明測定結(jié)果不能和用其他方法得到的結(jié)果進行互換。對病人的治療后監(jiān)測，單次PSA檢測結(jié)果不能用于前列腺癌復發(fā)的診斷。根部前列腺切除手術后，

38、PSA的持續(xù)升高（基于多次PSA的檢測結(jié)果）指示疾病的復發(fā)，若用超靈敏度分析進行根部前列腺切除手術后的跟蹤隨訪（超靈敏度分析唯一的臨床應用），應對實驗的靈敏度進行驗證，并將其報告給臨床醫(yī)生，更重要的是要研制出質(zhì)控品并達到要求的靈敏度。有些較低的檢測結(jié)果在生物學變異范圍內(nèi)可能會變得很高，因此持續(xù)升高的PSA水平應該引起高度重視。EGTM的觀點是PSA超靈敏度分析實驗的結(jié)果不應用于決定臨床治療方案。 </p><p>

39、;<b>　　肺癌標志物</b></p><p>　　分析測試前的注意事項：用于肺癌腫瘤標志物檢測的樣本應存放于4℃（短期）和-70℃（長期）。當融化冰凍樣本進行細胞角蛋白測定時，應避免樣本的劇烈混合，因為劇烈震蕩后細胞角蛋白可能會附著在試管壁上。用于NSE檢測的樣本應在采集的血液凝集后60分鐘內(nèi)進行分離，注意避免存在于紅細胞內(nèi)的NSE漏出。溶血的樣本不能進行NSE檢測。用于SCCA檢測的樣