化工專業(yè)優(yōu)秀畢業(yè)論文模板(精華版)

1、<p>　　寶雞文理學院化學化工學院畢業(yè)論文</p><p>　　2013年5月28日</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　摘要1</b></p><p><b>　　關鍵詞1</b></p><p>　

2、　Abstract……………………………………………………………………… ………………...…..1</p><p>　　Keywords…………………………….………………………………………………..……......….. 2</p><p><b>　　1 前言3</b></p><p><b>　　2 實驗部分4</

3、b></p><p>　　2.1 主要試劑及儀器4</p><p>　　2.2 熒光光譜的測量4</p><p><b>　　3 結果和討論5</b></p><p>　　3.1 非標記分子信標的設計5</p><p>　　3.2 GSMB探針的表征5</p>&l

4、t;p>　　3.3 使用非標記分子信標檢測目標DNA8</p><p><b>　　4 結論9</b></p><p><b>　　參考文獻11</b></p><p><b>　　謝 辭12</b></p><p>　　萘啶類熒光小分子在缺陷DNA腔體內熒光行

5、為的研究</p><p><b>　　楊世明</b></p><p>　　(寶雞文理學院 化學化工學院，陜西 寶雞 721007)</p><p>　　摘 要：本文主要研究了把熒光小分子作為信號物質用于構建信號增強型非標記分子信標。利用兩段單鏈DNA雜交形成一個發(fā)卡DNA結構，發(fā)卡DNA的莖狀部分形成了一個空缺位點，空缺位點對面是C堿基。熒光

6、雜環(huán)小分子ATMND通過氫鍵識別未配對的C堿基并嵌入空缺位點，ATMND熒光發(fā)生淬滅。當向體系加入與分子信標環(huán)狀部分互補的目標連時，分子信標環(huán)狀部分打開，ATMND與目標堿基結合的微環(huán)境發(fā)生變化，ATMND被釋放出，其熒光強度恢復表明目標鏈的存在。本文研究了影響小分子熒光淬滅的因素，優(yōu)化了實驗條件。研究發(fā)現(xiàn)，當加入目標DNA鏈時，ATMND熒光強度恢復，而加入含有錯配堿基的目標鏈時，熒光恢復不明顯，表明我們的非標記分子信標可以有效的區(qū)分

7、完全互補鏈和單堿基錯配目標DNA。</p><p>　　關鍵詞：2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶; 熒光法; 空缺位點探針 </p><p>　　Label-free fluorescent molecular beacon based on a small fluorescent molecule</p><p>　　non-covalently bou

8、nd to the intentional gap site in the stem moiety</p><p>　　Yang Shi-ming</p><p>　　( College of Chem. & Chem. Eng., Baoji University of Arts & Sciences, Baoji 721007 Shaanxi )</p>

9、<p>　　Abstract：A label-free ?uorescent molecular beacon (MB) based on a ?uorescent molecule, 5,6,7-trimethyl-1,8-naphthyridin-2-ylamine (ATMND) which is non-covalently bound to the intentional gap site in the stem m

10、oiety of the label-free MB, was developed. a label-free molecular beacon (MB) based on non-covalent binding of a fluorescence molecule, 5,6,7-Trimethyl- 1,8-naphthyridin-2-ylamine (ATMND), to the intentional gap site in

11、the stem moiety of a hairpin DNA has been developed. When the free-labe</p><p>　　Key words: 5,6,7-Trimethyl-1,8-naphthyridin-2-ylamine; Fluorescent method; Gap site</p><p><b>　　1 前言</b&

12、gt;</p><p>　　DNA的雜交序列特異性的檢測，已經引起了包括分子診斷、環(huán)境檢測等領域的廣泛關注, 因此，對敏感性和選擇性探針的需求越來越多。DNA序列分析是現(xiàn)代分子診斷學的基礎，對于各種遺傳類疾病、病毒或細菌的感染、遺傳與變異都有重要意義。尤其對于基因藥物治療、靶向釋放等水平上的個性化用藥，最終都依賴于基因測序結果。近年來，DNA測序技術的飛速發(fā)展，加速了人類基因組計劃的完成，對基因結構分析和功能研究

13、做出了巨大的貢獻。長期以來由于特異性DNA探針的大量需求，各種分子工程在最近幾年迅速發(fā)展起來了。包括熒光共振能量轉移（FRET）探針、臨近探針、熒光探針等。在這些DNA探針中，由于分子信標的穩(wěn)定性和特異性的特點，受到極大的關注。傳統(tǒng)的分子信標是有莖環(huán)結構的低核酸探針。當一個分子信標與它的遺傳微粒，隨著莖的曲張導致熒光恢復，它經歷了一個自發(fā)的構象重組。其獨特的目標識別和信號傳導的能力的關系已經在許多生物化學和生物學中大量的運用，包括定量聚

14、合酶鏈式反應，DNA-蛋白質相互作用，多基因分析以及信使RNA在活細胞中的表達等。</p><p>　　從1996年第一次發(fā)現(xiàn)分子信標到現(xiàn)在，利用信標在檢測盒研究的技術得到了不斷地提高和進步。新類型的分子信標已經發(fā)展到了波長的移動和酶的增加與電化學信號之間的相互轉化。分子信標是一種新型的可以特異識別核酸序列的熒光探針，這種熒光探針通過與核酸靶分子進行雜交后構象發(fā)生變化而發(fā)出熒光，他們將其命名為分子信標(MB) 。

15、分子信標具有靈敏度高、背景信號低、特異性識別性強、操作簡單以及可進行實時檢測等優(yōu)點，在近幾年內得到了迅速發(fā)展，并已廣泛地應用于實時監(jiān)測聚合酶鏈反應（PCR）、基因突變的快速分析、DNA、RNA 的檢測、DNA/RNA雜交的動力學研究以及DNA/蛋白質相互作用研究等，其應用領域仍在不斷拓展。雖然使用了傳感器系統(tǒng)，在許多情況下，即使是允許一個單核苷酸錯配的檢測，系統(tǒng)仍然需要特定的標記探針例如熒光染料，因此設計一個基于光學的原理來探測的方法來

16、替代分子信標的寡核苷酸標記是使用最廣泛的。利用在DNA鏈中嵌入染料的方式來檢測在溶液中的雙鏈DNA，作為一個簡單的和無標記的探針設計方法，這種方法在分子信標的情況下有內在的局限性。這是因為染料可以嵌入在MB的干部分產生一個大的干擾。一些小的熒光分子</p><p><b>　　圖1 實驗原理圖</b></p><p><b>　　2 實驗部分</b&

17、gt;</p><p>　　2.1 主要試劑及儀器</p><p>　　2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶(ATMND)、二甲基砷酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）。實驗中所用試劑均為分析純，實驗用水均為高純水。DNA由上海生工生物工程技術公司生產合成，序列如表1所示。</p><p>　　RF-5301熒光分光光度計(日本島津）、PC紫外-可見分光光度計（

18、日本島津）。</p><p>　　2.2 熒光光譜的測量</p><p>　　用帶有熱電溫度控制盒的熒光分光光度計在370到500nm波長范圍內測量，熒光激發(fā)波長350nm。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為0.5nm到2.0nm之間，掃描速度為100nm/min。</p><p>　　表1 探針和目的寡核苷酸設計</p><p><b>　

19、　3 結果和討論</b></p><p>　　3.1 非標記分子信標的設計</p><p>　　如圖1所示，非標記分子信標是由一個小的熒光分子組成的，含有47個核苷酸的DNA鏈（M1），并含有15個核苷酸的DNA鏈（S1）。S1鏈是15個堿基序列互補的（斜體M1由15個堿基構成）在M1末端的3、上。M1/S1合成體，是由胞嘧啶的相反的缺口位點組成，一個發(fā)夾結構（下劃線基地M1）

20、組成的6個堿基對干和19個環(huán)序列（斜體下劃線的基地和M1寫），是由退火溶液M1（2μm）和S1（2μm）構成的。把2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶（2μm）添加到M1 /S1復合溶液形成更復雜的M1 / S1 / 2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶溶液。上面描述的就是非標記分子信標的設計，稱之為GSMB。通過對2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的實驗，不成對的胞嘧啶將會在S1/M1復雜的缺口位點緊密結合，導致其

21、熒光猝滅。一個打開的發(fā)夾結構將會從GSMB中釋放出2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶。</p><p>　　3.2 GSMB探針的表征</p><p>　　為了證明所示的方法的可行性，我們評估了GSMBs的熒光在遺傳微粒上的缺失以及在目標基因變化后的熒光情況。圖2顯示了2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的熒光光譜（2μm）在含有100mM 氯化鈉和1mM四乙酸二氨基乙烯的

22、10mM的二甲胂酸鈉緩沖溶液變化情況。在M1/S1分子的復雜結構情況下，2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶熒光表現(xiàn)出的發(fā)射波段在401nm處的和最多（曲線a）。然而，2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶除了比M1/S1分子結構復雜外（圖2，曲線b），其熒光表現(xiàn)出顯著的猝滅現(xiàn)象，2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的熒光從201u減少到11u。在2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的熒光強度略有下降時，觀察到一個

23、ss的M1，S1或完全匹配的雙鏈的存在。一個小的熒光分子可以通過氫鍵的為成對堿基結合在DNA雙鏈上。這導致分子的熒光猝滅。這些結果表明，2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶納入M1/S1分子結構的復合物的干基部分的缺口位點中，是通過氫鍵來結合胞嘧啶的。在對GSMBs的其他的cDNA的反應進行研究，如圖2所示，在加入1.5μM的</p><p>　　圖2 加入M1/S1復合物前后ATMND的熒光光譜</

24、p><p>　　Fig. 2. Fluorescence spectra of ATMND before (a) and after bound to M1/S1 complex to form GSMB (b). (a) ATMND alone (2.0 μM); (b) GSMB (ATMND (2.0 μM) in the presence of M1/S1 complex (2.0 μM)). Spectra

25、 (c) is ?uorescence spectra of GSMBs (M1/S1/ATMND complex, 2.0 μM) in the presence of target cDNA (1.5μM). Sample solutions were adjusted to pH 7.0 with 10 mM sodium cacodylate containing 100 mM NaCl and 1 mM EDTA.</p

26、><p>　　為了定量地確定2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶胞嘧啶在缺口位點的M1/S1的復雜情況，對2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的熒光滴定法進行了研究。在401nm處的熒光強度所產生的變化提供了一個按1:1[1/S1分子結構復雜]/[2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶]的測定終點，說明2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶形成了穩(wěn)定的1：1的復合物與M1/S1復雜的缺口位點。結合

27、常數(shù)K值8.1×106M-1，在本實驗滴定曲線測定下，得出2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶含有不共價結合的DNA。</p><p>　　這種非標記分子信標采用“信號”的方法，重點考慮的是讓靈敏度達到最高。作為常識，宏塊的靈敏度可以通過增加熒光團的強度或提高猝滅劑的效率提高。一個小的熒光分子可以捆綁到一個未成對的基地，這就是側翼的結合位點的堿基與一個未成對堿的氫鍵和堆疊。因此2-氨基-5,6,7

28、-三甲基-1,8-萘啶的熒光猝滅效率可能會受未成對的胞嘧啶在復雜的M1/S1的缺口位點的影響，即使在2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶和胞嘧啶堿基之間有互補的氫鍵，也無法避免。為了檢查側翼堿基上熒光猝滅的效果，我們研究了2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶序列在一個單一的胞嘧啶M1/S1復雜干部分的依賴性結合的缺口位點。如圖2所示，最強的淬滅是2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶綁定的M1/ S1復雜的具有GG堿基對

29、在5、和3、側間隙站點（圖3），在401nm處的熒光強度猝滅高達95%，在基準2.0μM處，M1/S1分子結構復雜。對于其他的側鏈堿基（圖3，光譜b-e），觀察到的熒光猝滅是相對穩(wěn)定的，在那兒的順序是T-T(74%)<C-C(76%)<A-A(83%)。</p><p>　　圖3 側鏈堿基對探針識別性能影響的考察</p><p>　　Fig. 3. Fluorescence s

30、pectra of ATMND (2.0μM) in the presence of 2.0μM M1/S1 complex with different ?anking bases.</p><p>　　這些結果表明，雖然在2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶和胞嘧啶堿基之間互補的氫鍵發(fā)揮了很重要的作用，但是缺口位點依然對熒光猝滅效率產生了影響。所以在GSMs中我們選擇5、和3、的GS缺口位點。在紫外線范

31、圍內的CD光譜可以用來監(jiān)測DNA的構象轉變。如果確定的構象發(fā)生變化，結合后的2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶在M1／S1復雜的莖部分的缺口位點，鎘的實驗進行了M1/S1復雜之前和之后的2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶結合。在沒有2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶和遺傳微粒時，M1/S1分子結構的復合物顯示在250nm處取得負峰值，在275nm處取得正峰值，這是在一個莖部分的螺旋特征的β-構象。而添加2-氨基-

32、5,6,7-三甲基-1,8-萘啶后，在M1/S1/2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶沒有觀察到明顯的復雜誘導CD（GSMBs）,表明2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶與胞嘧啶堿基的結合，莖的部分的缺口位點不誘導M1／S1復雜的的構象變化。因此，它不影響靶DNA的雜交動力學。我們推斷在250nm處的CD峰值的增加是由于GSMB環(huán)遺傳微</p><p>　　3.3 使用非標記分子信標檢測目標DNA&l

33、t;/p><p>　　由于2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的熒光猝滅效率與濃度和M1/S1分子結構有關系，為了優(yōu)化條件，我們選擇2μM的濃度，實現(xiàn)了良好的靈敏度。在最佳條件下，在校準曲線的基礎上獲得三組平均測量值（圖4）。</p><p>　　圖4 目標鏈的濃度與ATMND熒光強度關系圖</p><p>　　Fig.4. Fluorescence spectr

34、a of a GSMB after hybridization with (from up to down) 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, and 0 μM of cDNA, respectively.</p><p>　　如上圖所示，正如預期的那樣，當信號增強時，觀察到熒光強度在50nM到1.5μM的范圍內，與cDNA濃度成正比。線性回歸方程為I = 11+8

35、1c(μM)(r=0.9923),檢測限為20nM，經過多次重復測量，得出用7個測量值的相對標準偏差小于5%。對GSMB的觀察報告表明，分子信標的選擇性一般是歸因于莖環(huán)結構的構象。對GDSMB選擇性研究測量分別為1.5μM遺傳微粒(cDNA)雜交后的GSMBs熒光，1.5μM單堿基錯配的DNA(TM)，1.5Μ雙堿基的寡核苷酸（TM2），1.5μM四個堿基不匹配的寡核苷酸（TM4）和1.5μM全匹配DNA。所有的結果都顯示在圖5中。對于

36、全匹配DNA，幾乎沒有觀察到什么響應（數(shù)據(jù)未顯示）。該GSMBs回應的單堿基錯配，但反應明顯小于全匹配DNA（圖5）。對應背景熒光GSMNs上觀察到的發(fā)光強度，雜交的全匹配DNA和在溶液中的單堿基錯配的DNA分別提高了13倍和4倍，這表明對目標序列的選擇性比較高。兩個堿基錯配寡核苷酸（TM2）顯現(xiàn)出了一個接近五分之一分子信標中加入與環(huán)狀區(qū)互補的目標鏈Target后，分子信標可與目標鏈Target形成相對剛性并且更加穩(wěn)</p>

37、<p>　　圖5 含有雙堿基錯配的目標鏈對ATMND熒光強度的恢復</p><p>　　Fig 5. Fluorescence quenching of hybridization solution includes fluorescence intensity of solution includes double basic group mispairing target is lower th

38、an the complementary target.</p><p><b>　　4 結論</b></p><p>　　在這次試驗研究中，將傳統(tǒng)的分子信標結構改變，延長分子信標莖狀部分并在其中設計一個空缺位點，使得熒光雜環(huán)小分子ATMND可以與空缺位點對面的C堿基特異性結合，來構建非標記信號增強型熒光分子信標。在這個過程中，由于與C堿基結合后，ATMND結構發(fā)生變

39、化，使得ATMND的熒光會發(fā)生淬滅。向分子信標體系加入與環(huán)狀部分完全互補的目標鏈，通過熒光檢測，發(fā)現(xiàn)ATMND熒光有一定的恢復。同時也考察了含有錯配堿基的目標鏈對ATMND熒光的恢復。實驗結果表明，完全互補的目標鏈可以很明顯的與含有錯配堿基的目標鏈區(qū)分。當非標記分子信標增加時與全匹配DNA雜交產生強烈熒光現(xiàn)象，然而，熒光強度稍微一點點的增加都會導致得到不匹配的DNA序列。因此，非標記的分子信標在這項研究中是有用的探針，可以用來區(qū)分他們的

40、目標和單堿基錯配的DNA序列。不同于傳統(tǒng)的分子信標，在這項研究中的非標記的分子信標和其他有用的功能的測試效果都是比較顯著的。在使用分子信標進行堿基錯配分析時，對錯配位點的位置沒有特別的要求，改變錯配堿基的位置，并不能改變分子信標的特異性，也不會影響反應結果的準確性，同時證明了分子信標比普通線性核酸探針的應用具有更</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p

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50、[Ｍ]．第二版. 北京：北京大學出版社，2009：40-79．</p><p><b>　　謝 辭</b></p><p>　　本論文是在寶雞文理學院化學化工學院張紅鴿老師的指導下完成的，值此論文完成之際，我謹向張老師以及所有給予我?guī)椭?、關心我進步的老師和同學表示誠摯的感謝。 </p><p>　　回想這段時間，由于開始理論知識的不足，還

51、有實驗操作方面的不熟練，在自己的實驗過程中遇到了很多問題，然而在面對一個個的問題和解決的過程中，也讓我學到了很多東西。不但豐富了自己的理論知識，同時實驗技能也得到了很大的提高。值此之際，衷心的感謝我的指導老師張紅鴿老師，在整個畢業(yè)論文的完成中，給了我很大的支持和鼓勵，也經常詢問我的實驗情況，并給予我所需要的幫助。同時，我也感謝和我一起在進行畢業(yè)論文實驗的同學，大家互相討論，互相學習，互相幫助，得到共同提高。通過這次畢業(yè)論文，我的實驗操作

52、能力和綜合能力都有所提高，對于我今后的學習和工作都將是寶貴的財富！</p><p>　　總之，論文的完成凝聚著眾多幫助過我的老師和同學的汗水和希望，敬請讓我留存于心，在將來的生活和學習中，我會加倍努力表達對他們的誠摯謝意。</p><p>　　在此即將畢業(yè)之際，祝福學校，祝福老師，祝福同學，祝福所有的人！</p><p>　　有志者，事竟成，破釜沉舟，百二秦關終屬楚