系列逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記的建立及其在柿屬植物中的應(yīng)用研究.pdf

1、本研究首先分離柿Tv1-copia類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子RNaseH-LTR序列并設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)座子引物，其次建立柿屬植物IRAP、REMAP、SSAP和ISTR系列逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記技術(shù)體系并應(yīng)用于柿屬植物種質(zhì)鑒定和親緣關(guān)系分析等方面，同時(shí)應(yīng)用非逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記AFLP和DAMD于柿屬植物，并比較了二者以及ISTR與柿屬特異性逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記在該屬植物遺傳分析中的性能，此外，對(duì)柿逆轉(zhuǎn)座子引物在它類(lèi)果樹(shù)物種及禾本科、茄科和薔薇科已發(fā)表的逆轉(zhuǎn)座子引物在果樹(shù)類(lèi)

2、作物上的通用性進(jìn)行研究，并對(duì)一份特殊種質(zhì)‘90-1-10’進(jìn)行了鑒定。主要結(jié)果如下：
　　 1．利用抑制PCR方法從‘羅田甜柿’（Diospyros kaki Thunb．‘Luotiantianshi’）基因組中分離31條Tv1-copia類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子的RNaseH-LTR序列，序列分析表明：至少有10個(gè)逆轉(zhuǎn)座予家族得到擴(kuò)增；其家族間序列普遍表現(xiàn)高度異質(zhì)，發(fā)生不同程度的堿基替換、插入或缺失突變，以及翻譯成氨基酸后的終止密碼子突變

3、、氨基酸取代和移框突變等；家族內(nèi)部某些序列相似性極高，類(lèi)反轉(zhuǎn)錄病毒中的準(zhǔn)種居群；序列LTR區(qū)含有啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特征“CAAT box”、“FATA box”以及受不同脅迫條件作用下的調(diào)控元件。序列投遞GenBank，登錄號(hào)為EU068698-EU068728。
　　 2．基于其中15條RNaseH-LTR（Long terminal repeat）序列共設(shè)計(jì)26條逆轉(zhuǎn)座子引物，包括8條正向LTR引物、10條反向LTR引物和8條PP

4、T（polypurine tract）引物。為增加特異性，引物設(shè)計(jì)過(guò)程中充分考慮其較長(zhǎng)長(zhǎng)度和高Tm值：長(zhǎng)度均在20bp～26bp之間，平均23bp；Tm值普遍高于55℃，平均為60.2℃。其中24條引物表現(xiàn)較好。
　　 3．優(yōu)化PCR反應(yīng)體系各組分濃度、退火溫度（Tm）和擴(kuò)增程序的基礎(chǔ)上建立起適合柿屬植物的逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記RAP（Inter-retrotransposon amplified polymorphism，逆轉(zhuǎn)座子之

5、間擴(kuò)增多態(tài)性）和REMAP（Retrotransposon-microsatellite amplified polymoiphism，逆轉(zhuǎn)座子-微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性）PCR擴(kuò)增技術(shù)體系：20μL反應(yīng)體系中，含1×Buffer、模板DNA50 ng、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs0.25 mmol/L、引物0.40μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U，礦物油20μL；PCR擴(kuò)增程序：95℃5 min；95℃1 min；56

6、℃1 min ramp+0.6℃/s；72℃2 min，循環(huán)44次；72℃延伸8 min。
　　 4．建立柿屬SSAP（Sequence-specific amplified polymorphism，特異序列擴(kuò)增多態(tài)性）逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記技術(shù)體系，并對(duì)可能影響其擴(kuò)增性能的幾個(gè)重要因素和不同逆轉(zhuǎn)座子在柿屬種質(zhì)遺傳關(guān)系研究中的特點(diǎn)進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，所有逆轉(zhuǎn)座子都產(chǎn)生豐富的多態(tài)性，表明每個(gè)逆轉(zhuǎn)座子都可單獨(dú)用于SSAP分析；SSA

7、P擴(kuò)增性能與逆轉(zhuǎn)座子自身的特點(diǎn)、選擇性擴(kuò)增酶接頭引物的種類(lèi)、組成及排序相關(guān)；不同逆轉(zhuǎn)座子在28份試材中表現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)座特點(diǎn)。研究為進(jìn)一步使用多逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記，以獲得較為全面的柿屬種質(zhì)起源進(jìn)化信息和進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)及種質(zhì)鑒定提供技術(shù)支持。
　　 5．建立適合柿屬植物的通用引物逆轉(zhuǎn)座子ISTR（Inverse sequence-tagged repeat，反向序列標(biāo)簽重復(fù)）分子標(biāo)記體系，與IRAP同時(shí)用于32份柿屬基因型的多態(tài)性和

8、親緣關(guān)系分析，并比較二者分析性能。結(jié)果表明，IRAP和ISTR均能很好的用于柿屬植物的遺傳分析；IRAP能區(qū)分供試所有基因型，包括芽變；ISTR不能區(qū)分‘富有’和其芽變‘松本早生’，但可以區(qū)分其它所有基因型；IRAP與ISTR的聚類(lèi)結(jié)果基本一致，但在細(xì)節(jié)上存在差異；IRAP在種間及種下分析所得的所有參數(shù)值（平均每次實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增總位點(diǎn)數(shù)、平均每次實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)百分率Pi、多樣性指數(shù)DI、有效多重系數(shù)EMR、標(biāo)記指數(shù)Marker

9、Index MI）均高于ISTR，總的來(lái)看，具有柿屬特異性的IRAP標(biāo)記系統(tǒng)的分析性能優(yōu)于通用引物的ISTR。
　　 6．探討IRAP用于柿屬植物種間關(guān)系研究的可行性，并與小衛(wèi)星分子標(biāo)記DAMD（Directed amplification of minisatellite-region DNA，直接擴(kuò)增小衛(wèi)星DNA）進(jìn)行多態(tài)性和聚類(lèi)分析比較。結(jié)果表明IRAP可以很好的用于柿屬種間親緣關(guān)系研究；DAMD作為首次應(yīng)用于柿屬植物的標(biāo)

10、記類(lèi)型，也表現(xiàn)出很好的擴(kuò)增性能，并能區(qū)分芽變；IRAP和DAMD聚類(lèi)基本均能將不同采集地的種按地理位置聚類(lèi)，但對(duì)中國(guó)熱帶、亞熱帶采集的柿種與溫帶栽培柿之間的關(guān)系存在分歧；兩種標(biāo)記用于柿屬植物種間親緣關(guān)系研究，在多態(tài)性水平、平均擴(kuò)增總位點(diǎn)等方面表現(xiàn)相當(dāng)，然而綜合擴(kuò)增性能評(píng)價(jià)IRAP較優(yōu)于DAMD。
　　 7．探討IRAP用于品種內(nèi)微小變異檢測(cè)的性能，以我國(guó)最大的‘磨盤(pán)柿’產(chǎn)區(qū)-北京市房山區(qū)張坊鎮(zhèn)上報(bào)的11株磨盤(pán)柿基因型作為試材，這

11、些試材在成熟期、果實(shí)外觀形態(tài)、抗性及耐貯性等方面性狀與標(biāo)準(zhǔn)品種存在差異。結(jié)果表明，19個(gè)逆轉(zhuǎn)座子單引物IRAP擴(kuò)增中，4個(gè)引物（PPT3，PPT6，SAF5和SAR10）在磨盤(pán)柿變異間具多態(tài)性，采用二歧法，該4個(gè)引物可將11份‘磨盤(pán)柿’變異完全區(qū)分；UPGMA聚類(lèi)圖上，磨盤(pán)柿變異與標(biāo)準(zhǔn)磨盤(pán)柿緊密相聚，分支模式顯著不同于種與種間及不同品種之間；相似系數(shù)計(jì)算表明，磨盤(pán)柿變異單株間的相似指數(shù)在0.90（‘MP2’與‘MP4’、‘MP8’、‘M

12、P9’）～0.98（‘MP7’和‘MP8’）之間，平均0.94，與磨盤(pán)柿標(biāo)準(zhǔn)品種‘BZMP’的平均相似指數(shù)為0.91，大于種間和品種間相似水平，與芽變間的相似水平接近?？偟目磥?lái)，本研究鑒定了供試的11份北京房山區(qū)磨盤(pán)柿的變異為遺傳物質(zhì)的改變，并非飾變；11份基因型之間以及與標(biāo)準(zhǔn)磨盤(pán)柿品種在遺傳上的高相似性表明，它們可能為磨盤(pán)柿的芽變類(lèi)型；IRAP分子標(biāo)記能夠很好的區(qū)分遺傳背景高度相似的微小變異，反映了該項(xiàng)技術(shù)是今后進(jìn)行柿品種鑒定，尤其是

13、遺傳差異較為接近的基因型，如芽變的有效工具。
　　 8．IRAP、REMAP和SSAP逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記用于28份柿屬植物種質(zhì)鑒定，16個(gè)柿逆轉(zhuǎn)座子引物在供試材料的單引物IRAP分析中檢測(cè)到豐富的擴(kuò)增位點(diǎn)，且高多態(tài)性比例（97.6％）；篩選出的7對(duì)REMAP引物和25對(duì)SSAP引物在相應(yīng)的分子標(biāo)記內(nèi)同樣檢測(cè)到豐富的多態(tài)性（分別為95.2％和93.4％）；每一類(lèi)型分子標(biāo)記均可成功鑒定28份種質(zhì)，其中2個(gè)IRAP引物（PPT3和SAR

14、10）及4對(duì)SSAP引物（SAR10/EA06、SAR9/MC03、SAR9/MC11、SAR1/MC11）可以單獨(dú)用于區(qū)分全部種質(zhì)。進(jìn)一步計(jì)算形態(tài)學(xué)相近和已知芽變關(guān)系的5組種質(zhì)各組內(nèi)基因型間的遺傳距離，量化每種逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記的鑒別效率表明：IRAP為3種逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記中進(jìn)行種質(zhì)鑒別最為靈敏的標(biāo)記類(lèi)型。
　　 9．IRAP、REMAP、SSAP和AFLP（Amplified fragment length polymorph

15、ism，擴(kuò)增限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）4種分子標(biāo)記在柿屬植物遺傳關(guān)系研究中的應(yīng)用效果比較表明：IRAP具有最高的多態(tài)性水平和多樣性指數(shù)；AFLP的多態(tài)性低于IRAP和SSAP，但具有最高的標(biāo)記指數(shù)；SSAP的標(biāo)記指數(shù)值低于AFLP，但其多態(tài)性高于AFLP；4種分子標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)矩陣間的相關(guān)性顯著，相對(duì)而言REMAP可靠性略差；4種分子標(biāo)記的聚類(lèi)結(jié)果基本一致，均可將28份種質(zhì)按種間及種下不同地理起源進(jìn)行劃分，然而聚類(lèi)細(xì)節(jié)因標(biāo)記種類(lèi)不同有別

16、。
　　 10．從‘羅田甜柿’中開(kāi)發(fā)的26個(gè)逆轉(zhuǎn)座子引物在其它果樹(shù)上的通用性試驗(yàn)表明：53.85％的引物可在供試果樹(shù)類(lèi)植物中獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，但不同引物在不同物種中的通用性各異，其中在柿屬、葡萄屬、柑橘類(lèi)和桃屬植物中的通用性較好。利用可通用引物在柿屬、柑橘類(lèi)、葡萄屬、桃屬和梨屬植物中的IRAP數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳關(guān)系分析的結(jié)果表明：這些引物在相關(guān)試材上還具有種質(zhì)區(qū)分、親子關(guān)系鑒定、分類(lèi)和系統(tǒng)關(guān)系研究以及遺傳多樣性評(píng)價(jià)等研究的潛力；同時(shí)還研究

17、了已發(fā)表的來(lái)自薔薇科、禾本科和茄科的逆轉(zhuǎn)座子引物在果樹(shù)類(lèi)作物上的通用性，進(jìn)一步佐證了逆轉(zhuǎn)座子引物可跨物種通用的特點(diǎn)，不同意前人的觀點(diǎn)。
　　 11．我國(guó)原產(chǎn)柿種質(zhì)中只有完全甜柿和完全澀柿兩種類(lèi)型，至今尚無(wú)不完全甜柿存在的報(bào)道。對(duì)引種自湖北省羅田縣的‘90-1-10’進(jìn)行形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)鑒定及生化和分子水平分析，結(jié)果表明，‘90-1-10’具有與中國(guó)原產(chǎn)柿種質(zhì)相近的果實(shí)特征，結(jié)合4種DNA分子標(biāo)記IRAP、REMAP、SSAP和AF