共聚焦顯微鏡-北京大學(xué)單分子與納米生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室

1、激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)技術(shù)簡介,He XiaohuiSu Meng 90513103Li Wei 90513104,Introduction LSCM 是一種高科技顯微鏡熒光顯微鏡成像為基礎(chǔ)，加裝了激光掃描裝置, 計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理, 使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針, 得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。無損傷的“光學(xué)切片”細(xì)胞三維立體機(jī)構(gòu)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析監(jiān)測,光學(xué)顯微鏡部分激光發(fā)射器掃描裝置

2、光檢測器計(jì)算機(jī)系統(tǒng)( 包括數(shù)據(jù)采集, 處理, 轉(zhuǎn)換, 應(yīng)用軟件) 圖像輸出設(shè)備,LSCM的基本組成,LSCM的原理,LSCM對生物樣品的觀察的優(yōu)越性：連續(xù)掃描 三維離子熒光標(biāo)記同時(shí)多重物質(zhì)標(biāo)記,LSCM的發(fā)展,,濾片式LSCM 棱鏡狹縫分光式LSCM,LSCM在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究中的應(yīng)用,LSCM常用于生物細(xì)胞或組織內(nèi)的分子原

3、位鑒定和定量,細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)觀察; 以及活體細(xì)胞或組織功能的動(dòng)態(tài)監(jiān)測. 在生命科學(xué)領(lǐng)域的分子水平,細(xì)胞及組織水平的研究中得到廣泛應(yīng)用.,一 原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子,觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu),在細(xì)胞原位用特異探針標(biāo)記出核酸,蛋白質(zhì),多肽,酶,激素,磷脂,多糖,受體等分子并用激光掃描共聚焦顯微鏡成像,從而實(shí)現(xiàn)上述大分子的定位,定性及定量檢測,,(一)在細(xì)胞原位檢測核酸(二) 原位檢測蛋白質(zhì),抗體及其他分

4、子(三)檢測細(xì)胞凋亡(四)細(xì)胞器觀察及測定(五)檢測細(xì)胞融合(六)觀察細(xì)胞骨架(七)檢測細(xì)胞間縫隙連接通訊(八)檢測細(xì)胞內(nèi)脂肪,(一)在細(xì)胞原位檢測核酸,檢測核酸的熒光探針1 碘化丙啶 (PI)---不能進(jìn)入完整的細(xì)胞膜2 Hoechst33342,Hoechst33258 和DAPI3 AO(吖啶橙),(二) 原位檢測蛋白質(zhì),抗體及其他分子,常用的熒光探針:1 熒光染料FITC: 藍(lán)光激發(fā),發(fā)出明亮綠色熒光

5、2 羅丹明: 比FITC光穩(wěn)定性好,在生理?xiàng)l件下對PH變化不敏感,熒光強(qiáng)度受細(xì)胞自發(fā)熒光的干擾較小,3 綠色熒光蛋白（ green fluorescent protein GFP）,,,,*可對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀察,(三)檢測細(xì)胞凋亡,通常用的方法:1 細(xì)胞核形態(tài)觀察2 脫氧核苷酸未端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)3 Annexin-V試劑盒是檢測凋亡細(xì)胞膜損傷的新方法,,(四)細(xì)胞器觀察及測定,不

6、同實(shí)驗(yàn)?zāi)康?標(biāo)記細(xì)胞器的方法也不同.,1線粒體 Mitochondria Rodamin 123 Mitotracker Green FM Mitotracker Orange CMTMRos Mitotracker Orange 2 溶酶體 Lysosome 中性紅 AO LysoTracker G

7、reen DND-26 / Blue/ Red3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC64 高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie,(五)檢測細(xì)胞融合,根據(jù)不同細(xì)胞的特性,將每一種細(xì)胞特有的物質(zhì)用不同的熒光控針標(biāo)記;融合操作后,確認(rèn)不同的熒光信號(hào)是否發(fā)生共定位于同一細(xì)胞;如在同一細(xì)胞中同時(shí)檢測 到上述不同的熒光信號(hào),則說明已經(jīng)發(fā)生了細(xì)胞融合

8、.,(六)觀察細(xì)胞骨架,骨架(微絲,微管和中等纖維)直標(biāo): 一抗+熒光探針(如:肌動(dòng)蛋白actin )間標(biāo): 二抗+熒光探針(如:微管蛋白tublin),,,肌動(dòng)蛋白(Actin)標(biāo)記肌動(dòng)蛋白是微絲的基本成分 毒傘素(鬼筆環(huán)肽)---與多聚體肌動(dòng)蛋白微絲專一性結(jié)合起來且親和作用強(qiáng)烈.,,,

9、微管蛋白(Tubulin)標(biāo)記,(七)檢測細(xì)胞間縫隙連接通訊,染料熒光黃(LY)---黃色帶電荷的小分子強(qiáng)熒光物質(zhì),不通過細(xì)胞膜,但可以很容易通過GJIC,從標(biāo)記的細(xì)胞(劃痕法)傳輸?shù)洁徑?xì)胞.觀察LY向鄰近細(xì)胞的傳輸速率,用以表示GJIC連接通訊功能,,漂白細(xì)胞(箭頭標(biāo)記)熒光漂白前(A)及漂白后0(B)、2(C)和4(D)min時(shí)的熒光恢復(fù)情況經(jīng)瞬間漂白后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯變?nèi)酰S著時(shí)問的推移．熒光逐漸恢復(fù)，至4

10、 min時(shí)(D)．可見熒光強(qiáng)度明顯恢復(fù)．,FRAP法測定膀胱平滑肌細(xì)胞GJIC功能,(八)檢測細(xì)胞內(nèi)脂肪,尼羅紅(Nile red):是一個(gè)理想的脂肪染色劑,它只在疏水環(huán)境中顯示很強(qiáng)的熒光.除了在所需顯示的脂質(zhì)中被溶解外,尼羅紅與組織不發(fā)生任何反應(yīng).,二 活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測,利用相應(yīng)的特異熒光控針標(biāo)記后觀察單個(gè)細(xì)胞不同部位或不同組織區(qū)域接受刺激后的整個(gè)變化過程,,(一)實(shí)時(shí)定量測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化(二)測定細(xì)胞內(nèi)

11、PH變化(三) 檢測膜電位的變化(四)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生(五)檢測藥物等跨膜進(jìn)入組織或細(xì)胞過程及其定位(六)檢測熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)(七)檢測熒光漂白恢復(fù)(FRAP),Fluo-3較為常用,基本原理:a其乙酰羥甲基酯(AM)形式是Fluo-3AM,無熒光,為不帶電荷的親脂性化合物,易于滲透脂膜進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi) b在胞內(nèi)被非特異酯酶水解,釋放出游離酸形式的熒光探針分子,此游離態(tài)也無熒光,不易漏出胞外c一旦

12、與Ca2+結(jié)合后便形成復(fù)合物,并有較強(qiáng)的熒光產(chǎn)生,從而發(fā)揮其鈣探針的作用.,KCL誘導(dǎo)的細(xì)胞外Ca++內(nèi)流測量,培養(yǎng)/分離的細(xì)胞 ? 20?M Fluo 3-AM負(fù)載液30-60min ? 清洗、換液 ? 掃描,,,(二)測定細(xì)胞內(nèi)PH變化,常用的熒光探針有BCECF和6-COFDABCECF的激發(fā)光譜是PH依賴性的比例法:即分別用490nm和440nm光激發(fā)BCECF所得到的發(fā)射熒光之比(比例熒光與PH有很好的線性關(guān)系)最

13、大分辯率為0.4PH單位.,(三) 檢測膜電位的變化,快響應(yīng)探針: 膜電位直接影響探針分子的電分布而改變其光譜,響應(yīng)快慢響應(yīng)探針: 主要通過改變其在膜內(nèi)外的分布來對膜電位的變化作出反應(yīng).跨膜運(yùn)動(dòng)需要一定的時(shí)間,所以反應(yīng)慢.,,依探針對電位變化響應(yīng)速度,將電位敏感探針分為快響應(yīng)探針和慢響應(yīng)探針,(四)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生,基本原理:a DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后b 經(jīng)酯酶作用脫去二酯,生成不發(fā)熒光的DCFHc 被超氧陰離子,

14、過氧化氫等活性氧化生成發(fā)熒光的DCF d 活性氧自由基的含量與熒光探針之熒光強(qiáng)度成正相關(guān),DCFH-DA常用于直接測定細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的動(dòng)態(tài)變化,(五)檢測藥物等跨膜進(jìn)入組織/細(xì)胞過程及定位,為檢測藥物分子,病毒,細(xì)菌等外界物質(zhì)能否跨膜進(jìn)入細(xì)胞/組織,需利用這些物質(zhì)特異性自發(fā)熒光/對其進(jìn)行熒光標(biāo)記.,(六)檢測熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),由于熒光蛋白的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn),其特定的熒光對理論上可用于活細(xì)胞中實(shí)時(shí)研究大分子間的相互作用.,熒光能

15、量共振轉(zhuǎn)移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer),I.熒光能量共振轉(zhuǎn)移: 受激態(tài)熒光素將其能量向另一個(gè)熒光素傳遞，使后者被激發(fā)，這一過程稱熒光能量共振轉(zhuǎn)移。能量的提供者叫供體熒光素，能量的接受者叫受體熒光素。,,供體熒光素 受體熒光素,1.供體與受體間的距離 <10nm或=1-7nm2.供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有實(shí)質(zhì)性的重疊,II.熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條

16、件,,,,,488nm 520nm 650nm,供體熒光素 (Cy2) 受體熒光素 (Cy3),,供體熒光素 (Cy2) 受體熒光素 (Cy3),(七)檢測熒光漂白恢復(fù)(FRAP),FRAP:是將待測細(xì)胞用熒光物質(zhì)標(biāo)記,借助高強(qiáng)度脈沖式激光照射細(xì)胞的某一區(qū)域,從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅;通過低強(qiáng)度

17、激光掃描成像,可以探測到該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子向受照射區(qū)域擴(kuò)散的速率.從理論上講,凡是能夠標(biāo)記待測分子,并且能夠發(fā)生熒光淬滅的熒光物質(zhì)都可以使用.,1. 熒光漂白恢復(fù) (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 檢測細(xì)胞連接間的信息傳遞,,,激光掃描共焦顯微鏡的發(fā)展趨勢,多光子激光掃描顯微鏡— Multiphoton Laser Scanning M

18、icroscopy在生物及醫(yī)學(xué)成像,單分子探測,三維信息存儲(chǔ),微加工等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,展示了廣闊的發(fā)展前景.,多光子激光掃描顯微鏡簡介,多光子激光器波長從700-1000nm連續(xù)可調(diào) 雙光子波長：350-500nm 連續(xù) 三光子波長：230-330nm 連續(xù)應(yīng)用：可直接清晰活體觀察某些非標(biāo)記神經(jīng)遞質(zhì)的分泌 (5-HT) 或 NADPH的分布,雙光子激光掃描熒光顯微系統(tǒng),照射光波長大于熒光染料吸收峰波長2倍 高

19、能量(2KW)、超短脈沖(兆分之一秒)聚焦, 使聚焦點(diǎn)瞬間產(chǎn)生高密度光子, 出現(xiàn)雙光子吸收激發(fā)熒光 雙光子吸收僅發(fā)生在聚焦點(diǎn), 避免了焦點(diǎn)外激發(fā)而產(chǎn)生的漂白現(xiàn)象高能量、超短脈沖聚焦、穿透性更強(qiáng) 50 ?m 500 ?m,,,,488nm 520nm,,FITC,,,,976nm,,,多光子激光掃描顯微鏡優(yōu)點(diǎn)與局限:,優(yōu)點(diǎn):1 對生物樣品的光損傷小2 有效觀測時(shí)間長3 穿透深