NO對(duì)鎘脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)與Cd積累的調(diào)控作用及其機(jī)制.pdf

1、鎘(Cd)是廣泛存在于自然界的一種重金屬元素，一氧化氮(NO)是一種普遍存在于生物界的信使分子，廣泛參與植物對(duì)各種環(huán)境脅迫包括Cd脅迫的應(yīng)答與反應(yīng)和調(diào)控的過程,紫花苜蓿（Medicogo sativa L.）具有清除土壤中高含量Cd、Cu或Zn的能力,是一種很有潛力的土壤修復(fù)植物。而對(duì)于作物整個(gè)生長(zhǎng)周期而言,種子的萌發(fā)過程是生理代謝最旺盛的階段。本實(shí)驗(yàn)用氯化鎘(CdC12)模擬Cd脅迫，采用NO供體SNP(Na2[Fe(CN)5NO]·

2、2H2O)、硝酸還原酶(NR)非專一性抑制劑疊氮化鈉(NaN3)、一氧化氮合酶(NOS)抑制劑L-NAME(N'-nitro-L-arginine-methyl ester hydrochloride)和NO專性清除劑c-PTIO(2-4-carboxyphenyl-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide)分別處理紫花苜蓿種子，通過分析Cd脅迫下紫花苜蓿種子內(nèi)源NO的產(chǎn)生及產(chǎn)生途徑，N

3、O對(duì)Cd脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)生長(zhǎng)、貯藏物質(zhì)積累、膜脂過氧化、抗氧化酶系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和Cd含量的影響，探討NO在植物逆境脅迫響應(yīng)中的作用及其機(jī)理。結(jié)果表明:
　　(1) Cd脅迫增加了紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中內(nèi)源NO的產(chǎn)生，表明NO信號(hào)與紫花苜蓿種子抵抗Cd脅迫有關(guān)。從處理第一天到第五天，NO含量總值呈現(xiàn)顯著性變化。隨著Cd處理濃度的增大，NO含量總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，或先上升后下降但各處理濃度下NO含量均顯著高于對(duì)照，這表明Cd脅

4、迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中有內(nèi)源NO的產(chǎn)生，且在50μmol/L Cd脅迫下NO產(chǎn)生量達(dá)到最高峰。
　　本研究選取了NOS、NR活性，亞硝酸根離子(NO2-)、類胡蘿卜素(Car)含量四個(gè)參數(shù)作為內(nèi)源NO產(chǎn)生途徑的代表。結(jié)果表明，隨著Cd處理濃度的增大，第一天、第三天和第四天的NOS活性呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)，即低濃度下增強(qiáng)，高濃度下減弱的效果;第二天和第五天的NOS活性總體呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。Cd處理使紫花苜蓿種子體內(nèi)的NO2-、C

5、ar含量發(fā)生了顯著變化。隨著Cd處理濃度的增大，紫花苜蓿種子體內(nèi)的NO2-、Car含量總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。四項(xiàng)指標(biāo)總體均與NO含量變化規(guī)律相似，表明Cd脅迫能誘發(fā)紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中內(nèi)源NO的產(chǎn)生，主要通過NOS催化，及NO2-在NR催化作用下或在Car和光的介導(dǎo)作用下產(chǎn)生。
　　不同濃度Cd處理下，NR五天的活性總量相對(duì)NOS活性、NO2-和Car含量而言更平穩(wěn)，說明苜蓿種子萌發(fā)過程中NR活性受Cd濃度影響相對(duì)較小。第

6、二天的NO含量較第一天相比有總體下降的趨勢(shì)，這與NOS、NR、NO2-早期變化規(guī)律均相似，說明種子萌發(fā)初期NOS、NR、NO2-可能起主要的調(diào)控作用。第三天至第五天NO含量逐步增加，這與NOS、Car、NO2-后期變化規(guī)律相似，說明種子萌發(fā)后期NOS、Car、NO2-可能起更主要的調(diào)控作用?？傮w而言，50μmol/L Cd處理使NOS、NR活性，NO2-、Car含量顯著增加，NO含量升高也最顯著。
　　(2) Cd脅迫顯著抑制了紫

7、花苜蓿種子萌發(fā)和生長(zhǎng)，使發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、種子活力指數(shù)和發(fā)芽指數(shù)，胚芽長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)以及胚芽、胚根鮮重較對(duì)照(CK)顯著降低。外源SNP處理能使上述參數(shù)較CK顯著升高，而Cd脅迫下SNP處理能緩解Cd脅迫對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的抑制作用，使上述參數(shù)較Cd單獨(dú)處理顯著升高，SNP的緩解作用卻被NO的清除劑c-PTIO處理抵消，使上述參數(shù)較Cd+SNP相比顯著下降，表明Cd脅迫可誘導(dǎo)內(nèi)源NO產(chǎn)生，外源和內(nèi)源NO都參與了紫花苜蓿種子對(duì)Cd脅迫的響

8、應(yīng)過程，能緩解Cd脅迫對(duì)植物萌發(fā)和生長(zhǎng)的抑制，增加發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、種子活力指數(shù)和發(fā)芽指數(shù)，胚芽長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)以及胚芽、胚根鮮重。
　　逆境脅迫下，NOS和NR通過產(chǎn)生NO在植物發(fā)揮著重要的作用。本研究中，Cd脅迫下，L-NAME、NaN3、NaN3+L-NAME處理使胚芽長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)較Cd單獨(dú)處理顯著降低。L-NAME處理下種子胚芽長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)顯著高于NaN3處理。發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和種子活力指數(shù)以及胚芽鮮重、干重有著相似的規(guī)律。說

9、明NaN3、L-NAME通過對(duì)NR、NOS的抑制顯著阻礙了紫花苜蓿種子萌發(fā)和生長(zhǎng)，進(jìn)而表明NR和NOS能通過促進(jìn)內(nèi)源NO的產(chǎn)生，增加Cd脅迫下紫花苜蓿種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和種子活力指數(shù)，胚芽、胚根長(zhǎng)以及胚芽鮮重、干重，緩解Cd脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制，且在促進(jìn)紫花苜蓿種子萌發(fā)和生長(zhǎng)方面，NR可能比NOS起著更主要的作用。
　　(3)發(fā)芽過程的特征是通過儲(chǔ)存物質(zhì)，如碳水化合物和蛋白質(zhì)等通過水解酶水解新形成的物質(zhì)用于形成新的結(jié)構(gòu)。

10、儲(chǔ)存物質(zhì)被水解酶水解為呼吸作用和各種合成代謝反應(yīng)提供能量，以形成代謝產(chǎn)物。負(fù)責(zé)這些儲(chǔ)備物質(zhì)如淀粉分解的酶是α-淀粉酶和β-淀粉酶，已有報(bào)道顯示，Cd脅迫會(huì)導(dǎo)致儲(chǔ)備物質(zhì)的動(dòng)員受到限制。本研究中，Cd脅迫顯著抑制了紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)的積累，使還原性糖、可溶性糖、可溶性蛋白、粗脂肪含量和α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶活性較CK顯著降低。而Cd脅迫下，SNP處理能緩解Cd脅迫對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)積累的抑制

11、作用，使上述參數(shù)較Cd單獨(dú)處理顯著升高，SNP的緩解作用可被NO的清除劑c-PTIO處理抵消，使上述參數(shù)較Cd+SNP相比顯著下降，表明Cd脅迫誘導(dǎo)內(nèi)源NO產(chǎn)生，NO參與紫花苜蓿種子對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)過程，緩解Cd脅迫對(duì)植物貯藏物質(zhì)積累的抑制作用，增加還原性糖、可溶性糖、可溶性蛋白、粗脂肪含量，促進(jìn)α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶活性。
　　Cd脅迫下， L-NAME、NaN3、NaN3+L-NAME處理使可溶性蛋白、

12、粗脂肪含量和α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶活性較Cd單獨(dú)處理顯著降低。相似地，與CK相比，NaN3、 L-NAME、NaN3+L-NAME處理均顯著抑制了種子體內(nèi)的還原性糖、可溶性蛋白、粗脂肪含量和α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶活性。說明NaN3、L-NAME通過抑制NR、NOS的活性從而顯著抑制了紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)的積累，表明內(nèi)源NO緩解Cd脅迫對(duì)種子萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)積累的抑制，減輕Cd迫

13、害。
　　(4)作為活性氧化還原金屬，Cd能夠誘導(dǎo)各種非生物脅迫下在幼苗中產(chǎn)生的ROS，如O2-·和H2O2的過度產(chǎn)生，這又導(dǎo)致膜脂過氧化;為了應(yīng)對(duì)和中和ROS的毒性，植物發(fā)展的內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)包括CAT，POD，SOD，APX，GR等抗氧化酶。本研究中，Cd脅迫下，紫花苜蓿種子體內(nèi)的MDA、H2O2、O2-·含量、REC與CK相比顯著升高，而SOD、 CAT、POD、APX、LOX活性也相應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)一步闡述了上述觀點(diǎn)，說明苜蓿

14、通過增強(qiáng)抗氧化酶活性來緩解Cd脅迫引起的膜脂過氧化，從而提高對(duì)Cd脅迫的抗性。而Cd脅迫下，SNP處理使種子體內(nèi)的MDA、H2O2、O2-·含量、REC和SOD、CAT、APX、LOX活性較Cd單獨(dú)處理顯著降低，說明Cd脅迫引起了活性氧(ROS)自由基的增加，致使紫花苜蓿種子發(fā)生膜脂過氧化，而外源NO的添加對(duì)膜脂過氧化現(xiàn)象有緩解作用;SNP的緩解作用可被c-PTIO處理抵消，使上述參數(shù)較Cd+SNP顯著升高，說明對(duì)苜蓿種子體內(nèi)NO的清除

15、會(huì)引起活性氧自由基含量水平的增加，進(jìn)而激發(fā)抗氧化系統(tǒng)作用。
　　Cd脅迫下，NaN3、L-NAME、NaN3+L-NAME處理使種子體內(nèi)的MDA、H2O2、O2-·含量、REC和SOD、CAT、APX、LOX活性較Cd顯著升高，說明NaN3、 L-NAME通過抑制NR、NOS的活性引起了種子體內(nèi)活性氧自由基含量水平的增加，進(jìn)而說明內(nèi)源NO可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的一般機(jī)制，通過增強(qiáng)抗氧化酶活性，清除H2O2，促進(jìn)O2-·轉(zhuǎn)化為H

16、2O2和O2，緩解植物的氧化損傷。
　　在總體水平上，隨著時(shí)間的推移，MDA、H2O2、O2·-、REC、Pro含量水平呈現(xiàn)逐漸積累的水平;而SOD、CAT、APX、GR活性亦呈逐漸增加的趨勢(shì)。說明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Cd誘導(dǎo)這些分子的過度積累導(dǎo)致了紫花苜蓿種子中的氧化損傷并抑制幼苗生長(zhǎng)。另一方面，POD、LOX活性則呈現(xiàn)總體先降低后升高的趨勢(shì)，表明NO和POD、LOX活性誘導(dǎo)之間的關(guān)系較為復(fù)雜，具體原因還需進(jìn)一步研究得知。
　

17、　(5)未外加Cd處理時(shí)，紫花苜蓿種子體內(nèi)Cd含量極低，而SNP、L-NAME、NaN3、L-NAME+NaN3、c-PTIO均使苜蓿體內(nèi)Cd含量水平顯著提高，疑似出現(xiàn)“假陽性”效果,原因有待進(jìn)一步研究。
　　Cd脅迫下，外源SNP處理使種子體內(nèi)Cd積累量較Cd單獨(dú)處理顯著升高，積累量為24.945μg/g; SNP的促進(jìn)效果可因c-PTIO的添加而被抵消，使Cd積累量較Cd+SNP顯著降低;說明外源NO在促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的同時(shí)，

18、也增加了植物對(duì)Cd的吸收，這與前人在紫花苜蓿幼苗中得到的結(jié)論不一致，可能是由于NO促進(jìn)了Cd的吸收，而部分Cd與一些絡(luò)合物結(jié)合而失活，從而未使Cd的積累對(duì)種子萌發(fā)造成致命的損傷。Cd脅迫下，L-NAME、NaN3、 L-NAME+NaN3處理使Cd積累量較Cd單獨(dú)處理顯著降低。說明苜蓿體內(nèi)NO的清除和NOS和NR活性的抑制會(huì)降低苜蓿對(duì)外界Cd的吸收，這說明內(nèi)源NO參與了紫花苜蓿種子對(duì)Cd脅迫的調(diào)控，增加了對(duì)外界Cd的吸收及積累。

19、　　總體來說，Cd脅迫誘導(dǎo)了內(nèi)源NO的產(chǎn)生，內(nèi)源NO在紫花苜蓿種子萌發(fā)及胚生長(zhǎng)、貯藏物質(zhì)、活性氧代謝及Cd積累方面均有顯著調(diào)控作用，而外源NO的添加能促進(jìn)這種調(diào)控作用，逆轉(zhuǎn)Cd對(duì)種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的負(fù)面影響。對(duì)NOS、NR活性的抑制及對(duì)NO的清除均會(huì)抵消SNP處理所帶來的積極作用。本研究促進(jìn)內(nèi)源NO生成的最佳Cd濃度為50μmol/L。
　　紫花苜蓿在修復(fù)重金屬如Cd、Cu、Pb等污染土壤方面的能力非常突出，而在中國(guó)有大面積種植紫花苜

20、蓿作為畜牧業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，由此可見其在應(yīng)對(duì)逆境環(huán)境下的發(fā)展前景很廣闊。光合作用是植物新陳代謝以生長(zhǎng)的基本生理活動(dòng)，對(duì)于NO在Cd脅迫下對(duì)紫花苜蓿凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及葉黃素循環(huán)是怎樣影響的還有待探討，這是下一步研究的方向和目標(biāo)。建議進(jìn)一步采用遺傳和蛋白質(zhì)組學(xué)分析及其他生理學(xué)方法，以了解外源NO在植物代謝功能中的細(xì)節(jié)，這將有助于進(jìn)一步了解這種多面體化合物，用于植物緩解不同種類生物和非生物脅迫，使紫