蛋白質(zhì)與氨基酸的測定

1、第七章     蛋白質(zhì)與氨基酸的測定,第一節(jié)概述第二節(jié)各種食品中蛋白質(zhì)含量及測定意義第三節(jié)蛋白質(zhì)換算系數(shù)第四節(jié)蛋白質(zhì)的測定方法,食品分析,第一節(jié) 概 述,pro是食品的重要組成之一，也是重要的營養(yǎng)物質(zhì)，一個(gè)食品的營養(yǎng)高低，主要看蛋白質(zhì)的高低。pro除了保證食品的營養(yǎng)價(jià)值外，在決定食品的色、香、味及結(jié)構(gòu)等特征上也起著重要的作用。,第七章   蛋白質(zhì)與氨基酸的測定

2、,,,一、pro組成與分類,1、組成pro是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，它的溶液是典型的膠體分散體系，由兩性氨基酸通過肽鍵結(jié)合在一起的大分子化合物，它主要含的元素是C 、H、O、N、S、P另外還有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。對(duì)于不同的pro，它的組成和結(jié)構(gòu)不同，但從分析數(shù)據(jù)可以得到近似的pro的元素組成百分比。,第一節(jié) 概 述,一般來說，pro的平均含氮量為100/160，所以在用凱氏定氮法定量pro時(shí)，將測得的總氮%乘上pro

3、的換稱參數(shù)K=6.25即為該物質(zhì)的pro含量。 注意：當(dāng)測定的樣品其含氮的系數(shù)與上面100/16相差較大時(shí)，采用6.25將會(huì)引起顯著的偏差。,第一節(jié) 概 述,一、pro組成與分類,2   氨基酸的組成 上面我們已講了pro是由氨基酸組成的高分子化合物，目前各種氨基酸已達(dá)175種以上，但是構(gòu)成pro的氨基酸主要是其中的20種，氨基酸是由脂肪酸碳鏈上的氫原子（NH2）所置換而得到的。,第一節(jié) 概

4、 述,一、pro組成與分類,二  pro變性 pro 受熱或其它處理時(shí)，它的物理和化學(xué)性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化，這個(gè)過程稱為變性作用，pro發(fā)生變性作用后，pro的許多性質(zhì)發(fā)生了變化，溶解度降低，發(fā)生凝結(jié)，形成不可逆凝膠，-SH暴露在外面，引起pro變性的因素主要是熱、酸和堿，化學(xué)試劑、重金屬鹽等。,第一節(jié) 概 述,第二節(jié)  各種食品中蛋白質(zhì)的含量及測定意義,一.含量 由于食品種類很多，所

5、以pro含量分布是不均勻的，一般動(dòng)物組織pro含量高于植物組織，而且動(dòng)物組織以肌肉內(nèi)臟含量較多于其他部分，植物是以種子含量高，豆類含pro最高，如黃豆pro含量在40%。,第七章   蛋白質(zhì)與氨基酸的測定,二.測定意義,1. pro是組成人體的重要成分之一，人體的一切細(xì)胞都由pro組成 2 .pro維持體內(nèi)酸堿平衡 3 .pro 是食品的重要組織部分之一，也是重要的營養(yǎng)物質(zhì) 4 .pro 是評(píng)價(jià)

6、食品質(zhì)量高低的指標(biāo)，還關(guān)系到人體健康。,第二節(jié)  各種食品中蛋白質(zhì)的含量及測定意義,第三節(jié) 關(guān)于氮-pro換算等數(shù),對(duì)于氮含量換算成pro含量的等數(shù)，歷來采用6.25，這個(gè)數(shù)值是以pro平均含氮而導(dǎo)出的數(shù)值，但是食品中含氮的比例，因食品種類不同，差別是很大的，我們在測定pro時(shí)，應(yīng)該是不同的食品采用不同的換算等數(shù)，一般手冊上列出了一部分換稱等數(shù)，用時(shí)可查，,第七章   蛋白質(zhì)與氨基酸的測定,蛋=

7、6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麥=5.83，玉米=6.25，小麥=5.83，麩皮=6.31，面粉=5.70，如果手冊上查不到的樣品則可用6.25，一般在寫報(bào)告時(shí)要注明采用的換算等數(shù)以何物代替。,第三節(jié) 關(guān)于氮-pro換算等數(shù),第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,pro的測定方法分為兩大類：一類是利用pro的共性，即含氮量，肽鏈和折射率測定pro含量，另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團(tuán)和芳香基

8、團(tuán)測定pro含量。但是食品種類很多，食品中pro含量又不同，特別是其他成分，如碳水化合物，脂肪和維生素的干擾成分很多，因此pro的測定通常利用經(jīng)典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾，用標(biāo)準(zhǔn)酸液吸收，用標(biāo)準(zhǔn)酸或堿液滴定，由樣品中含氮量計(jì)算出pro的含量。由于食品中pro含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。,第七章   蛋白質(zhì)與氨基酸的測定,一、  凱氏定氮法

9、 這種方法是1883年Kjeldahl發(fā)明，當(dāng)時(shí)凱氏只使用H2SO4來分解試樣，來定量谷物中的pro，他只知用H2SO4分解試樣，而不能闡明H2SO4分解有機(jī)氮化合物生成氨的反應(yīng)歷程，所以只使用H2SO4分解試樣，需要較長時(shí)間，后來由Gunning加入改進(jìn)，他改進(jìn)的辦法是在消化時(shí)加入K2SO4使沸點(diǎn)上升，這樣加快分解速度，因?yàn)闇囟扔稍瓉砹蛩岱悬c(diǎn)的380上升到400℃，提高了不到67℃所以速度也就加快了，凱氏定氮法至今仍在使用。

10、,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,我們在檢驗(yàn)食品中pro時(shí)，往往只限于測定總氮量，然后乘以pro核算等數(shù)，得到蛋白質(zhì)含量，實(shí)際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，故稱為粗pro。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,凱氏定氮法試驗(yàn)儀器圖,1、 凱氏常量定氮法：,不論常量、半微量以及微量定氮法它們的原理都是一樣的，首先第一個(gè)步驟是消化：（1）消化：樣品與硫酸一起加熱消化，

11、硫酸使有機(jī)物脫水。并破壞有機(jī)物，使有機(jī)物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而pro則分解氮，則與硫酸結(jié)合成硫酸銨，留在酸性溶液中。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機(jī)物分解，它與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀，可提高反應(yīng)溫度，一般純硫酸加熱沸點(diǎn)330℃，而添加硫酸鉀后，溫度可達(dá)400℃，加速了整個(gè)反應(yīng)過程。此外，也可以加入硫酸鈉，氫化鉀鹽類來提高沸點(diǎn)。其理由隨著消化

12、過程硫酸的不斷地被分解，水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大，沸點(diǎn)增加。加速了有機(jī)的分解。但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會(huì)分解，放出氨而造成損失。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,1、 凱氏常量定氮法：,（1）消化：,為了加速反應(yīng)過程，還加入硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。 所以有機(jī)物全部消化后，出現(xiàn)硫

13、酸銅的蘭綠色，它具有催化功能，還可以作為堿性反應(yīng)指示劑。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,1、 凱氏常量定氮法：,（1）消化：,（2）蒸餾：樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,1、 凱氏常量定氮法：,（3）吸收與滴定：    蒸餾過

14、程中放出的氨可用一定量的標(biāo)準(zhǔn)硫酸或標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行氨的吸收，然后再用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計(jì)算出總氮量。 半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,1、 凱氏常量定氮法：,操作步驟,準(zhǔn)確稱取樣品中0.50-2.00g→于500ml凱氏瓶中→加10g無

15、水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20ml H2SO4→在通風(fēng)櫥中先以小火加熱，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明無黑粒后，將瓶子搖動(dòng)一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→繼續(xù)消化30分鐘→至到樣液呈綠色狀態(tài)，停止消化，冷卻→加200ml水→連接蒸餾裝置→用硼酸作吸收液→在K氏瓶中加波動(dòng)珠數(shù)粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加熱→至到K氏瓶內(nèi)殘液減少到三分之一時(shí)，取出用水沖洗→用0.1N  HCl滴定。,第四節(jié) 

16、 蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,1、 凱氏常量定氮法：,計(jì)算：　　 總氮量%=  -----------------------------  ×  100       0.014----氮的毫克當(dāng)量數(shù)pro%=總氮%×K乳制品K=6.38（N=15.7%） 小麥粉K=5

17、.79（N=17.6%）動(dòng)物膠K=5.6（N=18.0%） 冰蛋K=6.7（N=14.8%）大豆制品K=6.0（16.7%） K=6.25則（N=16%）  K-換稱等數(shù),第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,1、 凱氏常量定氮法：,N（V2-V1）0.014,W,各種試劑的作用,（1）濃H2SO4： A：脫水使有機(jī)物炭化，然后有機(jī)物炭化生成碳，碳將H2SO4還原為SO2，本身

18、則變?yōu)镃O2 B： 氧化 C： pro與濃H2SO4生成NH3↑，CO2，SO2，H2O↑ D： NH3與H2SO4生成硫酸銨,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,（2）CuSO4的作用（催化劑）   CuSO4為紅色沉淀，當(dāng)C完全消化后，反應(yīng)停止，紅色消失，變?yōu)樘m色，即為消化達(dá)到完全，蘭色為CuSO4的顏色 （3）K2SO4的作用（提高沸點(diǎn)） 沸點(diǎn)由

19、330℃提高到400℃加速了反應(yīng)過程。 （4）硒粉和過氧化氫，氧化汞都為催化劑，但為了防止污染通常采用硫酸銅 (5)50%NaOH的作用,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,各種試劑的作用,下面我就針對(duì)幾點(diǎn)來說明為何影響氨化完全和速度快的因素（1）K氏燒瓶和取樣量 如果稱1g以上的樣品，就需要K氏燒瓶最小500ml，800~1000ml的更好，這樣的K氏燒瓶對(duì)于縮短氨化時(shí)間，加熱的均勻

20、性和完全氨化效果最好。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,（2）分解劑 ① H2SO4和K2SO4的添加量   有機(jī)無分解需要H2SO4量，H2SO4應(yīng)根據(jù)有機(jī)物種類不同而加的量就不同，如果試樣含脂類高，則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。 K2SO4和H2SO4的添加比例是： 1g樣

21、品     K2SO4：  H2SO4=7g：12ml 這種比例在國內(nèi)外都使用，是公認(rèn)的 還有一種比例：   K2SO4：H2SO4=10：20ml,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,② 催化劑    用作催化劑的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，對(duì)Hg，HgO有

22、毒但結(jié)果好，Se與CuSO4得到結(jié)果是一種，TiO2，的結(jié)果偏低，采用不同的催化劑則消化時(shí)間不同， HgO消化麥子為38，Se與CuSO4消化麥子55，TiO2消化麥子70，所以在給出測定結(jié)果時(shí)要注明催化劑的類型。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,（2）分解劑,（3）熱源的強(qiáng)度 消化時(shí)熱源的強(qiáng)度同迅速消化和完全氨化關(guān)系很大，即便鹽類K2SO4加得多，如果熱源弱，也是沒有意義的，熱源過強(qiáng)導(dǎo)致

23、H2SO4損失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，頸部的粗細(xì)和長短等，也與熱源的強(qiáng)度有關(guān)。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,(4）氨的蒸餾和吸收及滴定 蒸餾有兩種:  1  直接蒸餾（裝置簡便，準(zhǔn)確性好）2  水蒸汽蒸餾 蒸餾加NaOH是50%，加的量為H2SO4量的4倍，硫酸量為12ml，則NaOH為12×4=48ml，而且一般高于這個(gè)理論值

24、，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不夠就變成H2S， H2S是強(qiáng)酸，使顏色變紅。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,吸收液有：1、標(biāo)準(zhǔn)H2SO4 用標(biāo)準(zhǔn)堿返滴定，甲醛紅指示劑 2 、硼酸  用HCl進(jìn)行滴定，混合指示劑 目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強(qiáng)酸，要求較嚴(yán)，而硼酸是弱酸，在滴定時(shí)，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度

25、在3%以上可將氨完全吸收，為保險(xiǎn)期間一般用4%。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,(4）氨的蒸餾和吸收及滴定,實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng),a.樣品應(yīng)時(shí)均勻的，若是固體樣品應(yīng)事先研細(xì)，液體樣要混合均勻。b.樣品放入K氏燒瓶時(shí)，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結(jié)果偏低。c.消化時(shí)，如不容易呈透明溶液，可將K氏燒瓶放冷后，加入30%過氧化氫催化劑2~3ml，促使氧化。,第四節(jié)

26、60; 蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,d.在整個(gè)消化過程中，不要用強(qiáng)火，保持和緩的沸騰，使火力集中在K氏燒瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。e.如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會(huì)引起氨的損失，這時(shí)會(huì)形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當(dāng)硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時(shí)，要添加硫酸量。f.混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色，如果沒有溴甲酚綠，可單獨(dú)使用0.1

27、%甲醛紅乙醇溶液。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,g.氨是否完全蒸餾出來，PH試紙檢查餾出液是否為堿性。h.向蒸餾瓶中加入濃堿時(shí)，往往出現(xiàn)褐色沉淀無。這時(shí)由于分解促進(jìn)劑與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時(shí)Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡(luò)合物。i.消化劑綠色后繼續(xù)消化30分鐘即可。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,2、K氏微量定氮

28、儀法3、K氏半微量定氮儀法(2、3原理一樣) 操作方法大同小異，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸餾吸收液吸收。N（V2-V1）0.014W＊１０／１００  N（V2-V1）0.014計(jì)算總氮%=   --------------------------×100 -     

29、           W＊１０／１００,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,一、  凱氏定氮法,4、K氏自動(dòng)定氮法,原理與上面一樣，儀器，采用K氏自動(dòng)定氮儀：其裝置內(nèi)具有自動(dòng)加堿蒸餾裝置，自動(dòng)吸收和滴定裝置以及自動(dòng)數(shù)字顯示裝置，消化裝置：由優(yōu)質(zhì)玻璃制成的K氏消化瓶以及紅外線裝置的消化爐。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的

30、測定方法,一、  凱氏定氮法,氨基酸總量測定,pro經(jīng)水解或酶解可由大分子變成小的pro成分，如水解后的產(chǎn)物經(jīng)胨，肽等最后成為氨基酸，氨基酸是構(gòu)成pro最基本的物質(zhì)。 水解后的pro和水解前的pro在物理特性，化學(xué)結(jié)構(gòu)以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差別與水解的程度有密切關(guān)系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以評(píng)價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用

31、氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸（儀器價(jià)格昂貴，不能普遍使用），對(duì)于食品來說有時(shí)有很多種氨基酸可以同時(shí)存在于一種食品中，所以需要測定總的氨基酸量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸態(tài)氮）的百分率表示，當(dāng)然，如果食品中只含有一種氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以從含氮量計(jì)算出氨基酸的含量。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,氨基酸總量測定,食品在評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值時(shí)，除了測定pro的含量，氨基酸氮含量，還

32、需要對(duì)各種氨基酸進(jìn)行分離，鑒定，尤其對(duì)8種人體必需氨基酸進(jìn)行定量定性分析。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,氨基酸總量測定,單指示劑甲醛滴定法：,1、原理：氨基酸具有酸，堿兩重性質(zhì)，因?yàn)榘被岷?COOH基，而-COOH基顯示酸性，又含有-NH2，-NH2則顯示堿性，由于-COOH基和-NH2的相互作用，使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽，當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2與甲醛結(jié)合，其堿性消失，破壞內(nèi)鹽的存在，就可用堿來滴定-COOH基，以間接方

33、法測定氨基酸的量，反應(yīng)式以三種形式存在。 用堿完全中和-COOH基時(shí)的PH值為8.4~9.2。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,2、試劑：,（1）40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，將甲醛用1N NaOH溶液中和（淡蘭色）。 （2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。 （3）0.100N  NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,單指示劑甲醛滴定法：,3、操作步驟：,稱約含20mg左右的氨基酸→于燒杯

34、中（如為固體樣加水50ml）→加兩滴指示劑→用0.1N NaOH溶液滴定到淡蘭色→加中性甲醛20ml→搖勻→靜置1分鐘→此時(shí)蘭色應(yīng)消失→再用0.1N NaOH溶液滴定淡蘭色，記錄兩次滴定所消耗的堿液毫升數(shù)。 計(jì)算：氨基酸態(tài)氮=（N×V×0.014×100）　/W×100,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,單指示劑甲醛滴定法：,雙指示劑甲醛滴定法,1．原理 氨基酸具有

35、酸性的—COOH基和堿性的—NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)假如甲醛溶液時(shí)，—NH2基于甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定—COOH，并用間接的方法測定氨基酸總量。 2．試劑,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,3．操作方法 移取含氨基酸約20-30mg的樣品溶液2份，分別置于250mL錐形瓶中，各加50mL蒸餾水，其中1份加入3滴中性紅指示劑，用0.1mol/L氫

36、氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至由紅變?yōu)殓晟珵榻K點(diǎn)；另1份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20mL，搖勻，靜置1分鐘，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色為終點(diǎn)。分別記錄兩次所消耗的堿液mL數(shù)。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,雙指示劑甲醛滴定法,4．計(jì)算氨基酸態(tài)氮（%）=C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mol/L）;V2為用中性紅指示劑滴定時(shí)消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（ml）;V1為用百里酚酞作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶

37、液體積（ml）;m為測定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量（g）;0.014為氮的摩爾質(zhì)量（g/mol）,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,雙指示劑甲醛滴定法,5．說明及注意事項(xiàng)（1）此法適用于測定食品中的游離氨基酸。（2）若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測定。,第四節(jié)  蛋白質(zhì)的測定方法,雙指示劑甲醛滴定法,思考題： 1 、試述蛋白質(zhì)測定中，樣品消化過程所必須注意的事項(xiàng)，消化過程中內(nèi)容物顏色發(fā)生什么變化？為