獸用疫苗保護劑和佐劑

1、獸用疫苗凍干保護劑和佐劑,凍干保護劑（穩(wěn)定劑）保護劑：又稱穩(wěn)定劑（stabilizer） ，是指一類能防止生物活性物質(zhì)在冷凍真空干燥時受到破壞的物質(zhì)。（指對疫苗生產(chǎn)、血清制備等）保護劑用途（不同用途加不同保護劑, 主要針對活的微生物或細胞） ① 菌種或毒種保存：常用甘油作保護劑 ② 細胞株保存：常用二甲基亞砜(DMSO) DMSO:二甲基亞砜，一種細胞的保護劑 ③ 疫苗冷凍真

2、空干燥制備時：加脫脂乳（或二甲基亞 砜）和蔗糖等（不同國家有不同配方） ④ 干擾素類生物活性物質(zhì)的保存：加葡聚糖,保護劑（protector）的分類,分類：（根據(jù)其作用機理）——滲透劑：如二甲基亞砜（DMSO）、甘油和蔗糖等——非滲透劑：如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白質(zhì)等（根據(jù)其分子量大?。叻肿游镔|(zhì)、低分子物質(zhì)。（按其化學性質(zhì)）——復(fù)合物、糖類、鹽類、醇類、酸類和聚合物,復(fù)合物

3、 脫脂乳、明膠、蛋白質(zhì)、蛋白胨、糊精、血清、甲基纖維素等糖類 蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖等鹽類 乳酸鈣、谷氨酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、醋酸銨、硫代硫酸鈉等醇類 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等酸類 檸檬酸、酒石酸、氨基酸等聚合物 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等,一些常用的冷凍干燥保護劑,分 類

4、 保 護 劑,,,,疫苗凍干保護劑組成1. 營養(yǎng)液： 可修復(fù)因凍干而受損的細胞，使凍干制品含有一定量水分； 可促進高分子物質(zhì)形成骨架，使凍干制品呈多孔的海綿狀， 增加溶解度2. 賦形劑： 防止低分子物質(zhì)的碳化和氧化，保護活性物質(zhì)不受加熱影響 使凍干制品形成多孔性、疏松的海綿狀物，增加溶解度3. 抗氧化劑： 抑制凍干制品中的酶作用，增加生

5、物活性物質(zhì)在凍干后貯存期間的穩(wěn)定性，如維生素C、維生素E和硫代硫酸鈉等。,① 防止活性物質(zhì)失去結(jié)構(gòu)水及阻止結(jié)構(gòu)水形成結(jié)晶而導致生 物活性物質(zhì)的損傷；② 降低細胞內(nèi)外的滲透壓差、防止細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)水結(jié)晶，以保 持細胞的活力；③ 保護或提供細胞復(fù)蘇所需的營養(yǎng)物質(zhì)，有利于生活力的復(fù) 蘇和迅速修復(fù)自身。,凍干保護劑作用機制,二、影響保護劑效能的因素 1、保護劑種類: 根據(jù)微生物種類或者用途來添加不同種 類保護劑。２

6、、保護劑濃度：嚴格按照配方執(zhí)行。３、保護劑配制方法：糖類不能用121℃高壓滅菌處理。４、保護劑酸堿度（PH值）：主要對M的影響。,三、常用的凍干保護劑（穩(wěn)定劑） 明確不同種類微生物需要添加不同保護劑（一）細菌的保護劑 ① 需氧或兼氧厭氧菌：５％蔗糖脫脂乳或５％蔗糖、 1.5％明膠；　　　　　　　　　　　　　 ② 厭氧性細菌：含1.5％

7、谷氨酸鈉的１％乳糖或10％脫 脂乳或7.5％葡糖血清。 注：脫脂乳：20％脫脂奶粉溶于水配制而成。（二）病毒的保護劑 ① 5%蔗糖 脫脂乳； ② 馬立克814活細胞疫苗:保存液氮.穩(wěn)定劑為10%二 甲基亞砜和50%犢牛血清的199液。 注意: 微生物保護劑緩沖液的組成比例，不同廠家有

8、 不同的配方。,1．5%蔗糖（乳糖）脫脂乳保護劑 蔗糖（或乳糖）5g，加脫脂乳至100ml，充分溶解后，110~116℃高壓滅菌30~40 min。 2．明膠蔗糖保護劑明膠2%~3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲 1%~2%（g/m1）。先將12%~18%明膠液、30%蔗糖液和6%~12%硫脲液加熱溶解，116℃高壓滅菌30~40min； 3．SPGA保護劑,獸醫(yī)生

9、物制品常用的保護劑,蔗糖 76.62g、磷酸二氫鉀0.52g、磷酸氫二鉀1.64g、谷氨酸鈉0.83g、牛血清白蛋白10g、加去離子水至1000ml，混合溶解，過濾除菌。,免疫佐劑,一、佐劑概念與作用機理1. 佐劑（新概念）：凡是可以增強抗原特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)稱為佐劑。 佐劑（舊概念）：當一種物質(zhì)先于抗原或與抗原混合或同時注射于動物體內(nèi)，能非特異性地改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答,發(fā)揮其輔佐作用的物質(zhì). 以前

10、作為佐劑使用時沒有免疫原性，但現(xiàn)在有所改變，如IL-2是佐劑和IL-8一類細胞因子佐劑卻不一樣, 具有免疫調(diào)節(jié)和免疫增強作用,單獨使用時卻具有免疫原性。注意:佐劑和免疫增強劑的關(guān)系? 有時佐劑也是免疫增強劑.,作用特點：① 明顯增強抗原性微弱的物質(zhì)誘導機體產(chǎn)生 特異性免疫應(yīng)答。② 用最少的抗原和最少的接種次數(shù)，產(chǎn)生足 夠的免疫應(yīng)答。,免疫佐劑作用機理,① 改變正常免疫機能，吸引大量巨噬細胞以吞噬抗原；

11、② 改變抗原的構(gòu)型，使抗原物質(zhì)降解，并加強其免疫原性；③ 延長抗原在組織內(nèi)的貯存時間，使抗原緩慢降解和緩釋， 并發(fā)揮免疫系統(tǒng)的細胞間協(xié)同作用（巨噬細胞與T細胞， T細胞與B細胞）。,作用方式,① 抗原遞呈（antigen presentation） ② 抗原尋的（antigen targeting）③ 免疫調(diào)節(jié)（immune modulation）,作用機理,①抗原遞呈： 指抗原分子遞呈給T細胞的方法。佐劑與疫苗

12、聯(lián)合使用，有助于抗原性物質(zhì)在胞內(nèi)被加工，被MHC分子特異性的結(jié)合、保護、運輸并遞呈給效應(yīng)細胞。,②抗原尋的（antigen targeting） 指抗原傳遞給免疫系統(tǒng)中適當效應(yīng)細胞的效率。包括吸引巨噬細胞到達組織部位、活化吞噬細胞、促進抗原與細胞受體的結(jié)合等有重要作用。,③免疫調(diào)節(jié)（immune modulation） 是指任何可以修飾的免疫效應(yīng)細胞對抗原或表位進行加工的機制。通過這種機制，可以改變特異性免疫應(yīng)答的本質(zhì)或強度。T細

13、胞有Th1和Th2兩個亞類。同一抗原和不同佐劑一起使用能夠引起不同的免疫反應(yīng)。因此，通過篩選特定的佐劑，可以達到誘導正確的免疫應(yīng)答的目的。,1. 按佐劑物理性質(zhì) 顆粒型佐劑 非顆粒型佐劑2. 按佐劑的生物學性質(zhì)（即Ballanti分類法） 微生物及其組分 非微生物物質(zhì)3. 按佐劑在體內(nèi)存留的時間 貯存型佐劑（depot type adjuvant） 非貯存型（non-depot type adjuvant）,

14、佐劑的分類,（一）顆粒性佐劑1．鹽類佐劑 氫氧化鋁膠、明礬、磷酸鋁等。2．油水乳劑佐劑 弗氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant, FCA）、弗 氏不完全佐劑（ FIA）和礦物油白油佐劑。3．免疫刺激復(fù)合物佐劑（ISCOM）4．蜂膠佐劑（propolis）5．脂質(zhì)體佐劑（liposomes）。6．其他：MF59佐劑、微囊化佐劑（micro-encapsulation)

15、、 硬脂酰酪氨酸佐劑和γ－菊粉等。,（二）非顆粒性佐劑1．肽類佐劑（peptides）：胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物、 去胞壁酰多肽、脂肽和免疫調(diào)節(jié)多肽。2．表面活性分子類佐劑：海藻糖合成衍生物（TDM）3．核酸及其衍生物類佐劑：合成核苷酸聚合體、CpG 4．含硫復(fù)合物類佐劑：左旋咪唑5．碳水化合物高分子類佐劑：香菇多糖、DEAE-葡聚糖6．細胞因子類佐劑（cytokine）：IL-2、IL-4和γ-

16、IFN等。7．脂質(zhì)分子類佐劑：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性維生素8．其他：霍亂毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破傷風類 毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；維生素B12等。,合成方法: （1）用鋁粉加燒堿合成法 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O   

17、 A12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O（2）用明礬加碳酸鈉合成法 2 KAl(SO4)2+3 Na2CO3+3H2O→2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2↑ （3）用三氯化鋁與氫氧化鈉合成 A1C13+3NaOH→Al(OH)3↓+3NaCl,氫氧化鋁膠 (鋁膠）,用鋁粉加燒堿合成

18、法： 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O    A12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O,用銅紗篩濾過，用布袋脫水過夜，收存于容器內(nèi)，可約得600kg鋁膠。,取氫氧化鋁干粉50～55kg，加入6萬毫升沸水中，攪拌均勻;倒入硫酸100kg，爆沸至棕褐色，經(jīng)30～60min后，加溫水，邊加邊攪拌

19、約至總量為35萬毫升；用前加水稀釋至100萬毫升，溫度約為80℃，盛裝在一個缸內(nèi),另一缸盛80kg燒堿，加水至100萬毫升，加溫至75℃,兩液等量逐漸流入另一耐酸搪瓷缸內(nèi)，蒸汽吹沸熟化10min，調(diào)節(jié)pH 6.9土0.1，繼續(xù)熟化3min，穩(wěn)定pH 6.9土0.1,靜置沉淀，棄上清后加入約5倍量軟化水，攪拌洗滌、棄上清，如此3～5次，檢查至硫酸鹽合格為止。,,,,,① 氫氧化鋁吸附力較強，所以要用軟化水或去離子水洗滌。② 氫氧化鋁膠為

20、兩性化合物，過酸或過堿都會失去膠態(tài)。故要 掌握好化合時的pH值。③ 貯存鋁膠應(yīng)放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，嚴密封蓋，貯放期 不超過3個月。④ 鋁膠室溫保存，以免破壞膠態(tài)。,注意事項,是指一類由油類物質(zhì)和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑。 該類佐劑主要在抗原尋的過程中起作用，使抗原在注射部位保持穩(wěn)定，為抗原在淋巴系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運提供載體，增加單核細胞的形成和積聚。油乳劑疫苗的免疫效力高低，直接與乳化作用的好壞和乳劑成分的質(zhì)量等

21、有關(guān)。一種好的乳劑疫苗應(yīng)是油包水（W/O）或水包油（O/W）型，粘度低，顆粒均勻，穩(wěn)定性良好，呈乳白色。“乳劑”是將一種溶液或干粉分散成細小的微粒，混懸于另一不相溶的液體中所成的分散體系。被分散的物質(zhì)稱為分散相（內(nèi)相），承受分散相的液體稱連續(xù)相（外相），兩相間的界面活性物質(zhì)稱為乳化劑。,油乳佐劑,乳化劑 天然乳化劑：阿拉伯膠、海藻酸鈉、蛋黃以及煉乳 人工合成乳化劑離子型 陰離子類乳化劑：十二烷基磺酸鈉和硬脂酸鋁 陽

22、離子類乳化劑：氯化苯甲烴銨、溴化十六烷三甲基非離子型：月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和單油酸脂、 司本-80、吐溫-80,白油佐劑國內(nèi)外常用白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4 7號或10號白油質(zhì)量標準: 無色無味 50℃運動粘度7m2／s左右 紫外吸收A250-350＜0.1％，紫外消光系

23、數(shù)＜12×108； 單環(huán)芳烴與雙環(huán)芳烴含量低于0.5％，無多環(huán)芳烴； 小鼠腹腔注射0.5ml或家免皮下注射2.0ml白油，觀察60d，表現(xiàn)正常。,乳劑配方與乳化方法（1）劑在水中法： 將乳化劑直接溶于水中，在激烈攪拌下將油加入，可直接生成O/W乳劑。若欲得W/O型，可繼續(xù)加入油，直到發(fā)生變型。該法通常用勻漿器或膠體磨，高速攪拌而得到較好的乳劑。（2）劑在油中法： 將乳化劑溶于油相，將油相直接加入水相中

24、得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，繼續(xù)加入至變型。該法制成的乳劑，一般均勻顆粒直徑在0.5µm左右，比較穩(wěn)定。,免疫實驗動物用的佐劑配制: (1)弗氏佐劑：礦物油75%~85％，乳化劑15％~25%，混合后經(jīng)除菌過濾而成為FIA；如向其中加入0.5mg／m1死結(jié)核桿菌即為FCA。使用時，將含抗原的水相，與上述任一佐劑等量混合，用力振搖即可成為均勻的乳劑。(2) 白油佐劑：9份油和1份司本-80混合后

25、加2％吐溫-80和1％~2%硬脂酸鋁，經(jīng)高壓滅菌后備用，注射前將配好的油佐劑與抗原水相1：1混合，強力振搖，可配制成性狀良好的乳劑疫苗。,大量生產(chǎn)乳劑疫苗: 油相: 94％白油、6％司本-80、1%~2％硬脂酸鋁，滅菌即可； 水相：抗原液加2％~4%吐溫-80 乳化：將油相與水相按3：1~2：1比例配制，先緩速混合，再 通過膠體磨充分乳化，可獲得穩(wěn)定的油包水乳劑苗。 或者將粘稠的W/O乳劑疫苗，再加

26、2％吐溫-80生理鹽 水，通過攪拌或膠體磨乳化，可制成雙相乳劑疫苗。,油乳劑檢驗（1）粘度測定：流出法、Saybolt粘度計法。吸管內(nèi)口直徑為1.2mm，室溫下吸滿lml乳劑，垂直放出0.4ml所需時間作為粘度單位。以 2-6 S為合格，不得多于10-15 S。（2）乳劑穩(wěn)定性測定：① 加速老化法：疫苗于37℃貯存10-30d不破乳。② 離心加速分層法：3000rpm離心15min不分層，相當于保存1年以上

27、不破乳。,蜂膠佐劑（ Propolis）,是一種優(yōu)良的天然藥物 供免疫佐劑用的蜂膠外觀應(yīng)具備其固有的特征 具有廣泛的生物活性和藥理作用（抗菌、抗病毒、抗腫瘤、消炎） 具有免疫增強作用： 能保持抗原特性，增強巨噬細胞的吞噬能力，促進抗體的 產(chǎn)生，提高機體的特異性和非特異性免疫力。,（1）蜂膠的處理： 蜂膠（4℃以下貯存） 粉碎過篩 按1：4（W/V）加95％乙醇 室溫浸泡24～48h

28、 冷卻 過濾或離心取上清 透明栗色純凈蜂膠浸液 4℃以下保存?zhèn)溆?除去干渣計算出浸液中含蜂膠量。（2）蜂膠佐劑疫苗的制備： 滅活菌液或病毒液，加入蜂膠乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂膠10mg，邊加邊搖蕩，成為乳濁狀，即可。,,蜂膠佐劑疫苗制備方法：,,,,,,,,細胞因子類免疫佐劑 （cytokine）,細胞因子的概念 是機體的各種細胞在其生命周期中所釋

29、放的具有不同生物學效應(yīng)的物質(zhì)，是免疫細胞間相互作用的調(diào)節(jié)信號。該類物質(zhì)相互誘生，相互影響，構(gòu)成一個巨大的細胞因子網(wǎng)絡(luò)（cytokine network）系統(tǒng)，各種細胞借助自己所釋放的細胞因子完成各自的功能，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。,細胞因子類免疫佐劑 （cytokine）,細胞因子的分類（根據(jù)生物活性）1. 經(jīng)典的細胞因子：淋巴毒素（LT）、腫瘤壞死因子（TNF）

30、干擾素（INF）2. 對體液免疫和細胞免疫具有調(diào)節(jié)作用的因子： 白細胞介素（IL）和集落刺激因子（CSF）,1．多效性： ①免疫調(diào)節(jié)作用的多樣性 ②作用方式的非特異性：不表現(xiàn)抗原特異性2．靶細胞的多樣性：構(gòu)成機體細胞—細胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)3．多源性：4．高效性：有免疫激素（immune hormone）之稱5．快速反應(yīng)性：即對激發(fā)因素的迅速反應(yīng),

31、細胞因子的作用特點,多樣性Pleiotropism 交叉性Redundancy 協(xié)同性Synergy 對抗性Antagonism,1．作為免疫佐劑，提高疫苗的免疫效果2．作為免疫治療劑，預(yù)防和治療某些病原感染3．通過基因重組，構(gòu)建新型基因工程疫苗 IL-2-AIV-HA重組痘病毒,細胞因子的應(yīng)用,幾種重要的細胞因子,白細胞介素-2（IL-2） 白細胞介素-4（IL-4） 白細胞介素-12（IL-

32、12） γ -干擾素（IFN-γ）,刺激物為抗原或促有絲分裂原（ConA）； T細胞分泌； 無抗原特異性 糖蛋白，含133aa ，分子量15-35kDa； 70℃30min及pH值2-9范圍內(nèi)穩(wěn)定,IL-2,刺激物：抗原或絲裂原；由Th細胞產(chǎn)生分子量15～20kDa，有2～3個糖基化部位，140個氨基酸一種強有力的佐劑候選因子,IL-4,是目前發(fā)現(xiàn)的唯一主要由B細胞產(chǎn)生的細胞因子，與IL-2有協(xié)同作用，所以曾被稱為細胞毒淋

33、巴細胞成熟因子（CLMF）和天然殺傷細胞刺激因子（NKSF）。 糖蛋白，分子量75kDa，由40kDa（P40）和35kDa（P35）兩個亞單位構(gòu)成，兩個亞單位完全由不同的基因所編碼，只有結(jié)合為一個完整的分子時才能發(fā)揮生物學活性。 IL-12活性高于IL-2和IFN，在極低濃度時就有顯著活性，對滅活疫苗、腫瘤和寄生蟲抗原具有有效的佐劑活性。 IL-12誘導產(chǎn)生的Th1應(yīng)答反應(yīng)尤為引人注目，可望用于主要誘導細胞免疫應(yīng)答的疫苗佐

34、劑。,IL-12,由致敏T細胞在活的或滅活的病毒等干擾素誘生劑和某些細胞因子作用下所產(chǎn)生； 糖蛋白，分子量20～25kDa，由144個氨基酸組成。 有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和免疫佐劑等免疫生物學活性。 目前IFN-γ與抗原雜合的融合分子的研究是個熱點，期待其成為一個有效的佐劑。,IFN-γ,目前，我國已開發(fā)研制成功豬白細胞干擾素（swine interferon）。該制品系用雞新城疫病毒誘導健康豬白細胞，經(jīng)培養(yǎng)、滅活病毒、除菌、

35、分裝等工藝制成。用于防治豬流行性腹瀉。,CpG DNA，CpG OND,CpG DNA：指含有非甲基化CpG（胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸）基序的脫氧核糖核酸DNA。 CpG基序（ motif）：指以非甲基化的CpG為基元構(gòu)成的回文序列，其堿基排列大多為5′--Pur Pur- CG- Pyr Pyr--3′，具有較強免疫活性，稱為免疫刺激序列（ISS，immunostimulatory DNA sequences）。 CpG ON

36、D：含有非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸 。,細胞因子的分泌和細胞的分化,CpGDNA的免疫刺激效應(yīng)（作用機制）,,,,溫度\能量,,,酸化內(nèi)體小泡,,,,,,,,,,,,,,,,,,DNA-PK,TLR-9,胞質(zhì)內(nèi)受體蛋白,有絲分裂原蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子等信號通路,,,,,引起B(yǎng)細胞分化，分泌IL-6、IL-10等細胞因子和表達MHCII、B7-1、B7-2等表面分子，并阻止B細胞的凋亡。 直接激活單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞，分

37、泌IL-12、INF-r等Thl樣為主的細胞因子，并刺激MHCII、B7-1、B7-2的表達。 在IL-12協(xié)同下激活NK細胞，殺傷活性增強，并分泌IFN-r，IFN-r反過來進一步促進單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞的激活。 協(xié)同刺激抗原特異性B細胞和T細胞分化，在Thl細胞因子的作用下，顯著增強獲得性細胞免疫----優(yōu)良的T細胞免疫佐劑。,1． CpGDNA對多種免疫細胞有激活作用,含有GACGTT-基序的CpG OND——小鼠淋巴

38、細胞含有AGCGTG基序的CpG OND——小鼠的NK細胞含有GTCGTT基序的CpG OND——人淋巴細胞含有ATCGAT基序的CpG OND——雞外周血單核細胞含有GTCGTT基序的CpG OND—牛B細胞的增殖和分泌IL-6 —PBMC分泌IL-

39、6、IL-l2和IFN-r；含有ATCGAT基序的CpG OND——豬 (Kamstrup，2001),2．CpG OND免疫刺激作用具有物種和細胞特異性,CpGODN的體內(nèi)效應(yīng)與應(yīng)用1．對天然免疫系統(tǒng)的刺激活性 （1）抗感染 ：單核李斯特桿菌、利什曼原蟲、

40、 瘧原蟲、單純皰疹病毒 （2）抗腫瘤活性 ：黑色素瘤 2. 對特異性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用—疫苗佐劑 （1）CpG ODN對蛋白質(zhì)抗原的作用 能夠增強許多抗原誘導的Thl型反應(yīng)—HbsAg、牛皰疹病毒I型糖蛋白 D、淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、瘧疾的多肽、麻疹病毒、放線桿菌 胸膜肺炎、流感病毒疫苗、貓皰疹病毒、貓細小病毒和貓白血病病毒 （2）CpG ONG對DNA疫苗的作用3

41、．過敏性疾病治療,霍亂毒素（CT） 大腸桿菌不耐熱毒素（LT） 破傷風類毒素（TT）,基因工程減毒素,（一）霍亂毒素（CT） 良好的粘膜免疫佐劑 由A和B兩個區(qū)構(gòu)成的蛋白 B區(qū)具有主要免疫學作用，內(nèi)含5種獨立的非共價連接的B亞單 位（CTB），無毒性，可與細胞結(jié)合。 A區(qū)是CT的生物學活性部分，具有酶活性。 仙臺病毒—CT；CTB—流感病毒HA；鏈球菌表面蛋白—CTB； CT毒素A和B兩個亞單位的表達質(zhì)粒

42、DNA作為佐劑與DNA疫苗聯(lián)和應(yīng)用，還可誘導機體產(chǎn)生很強的Th1細胞因子反應(yīng)（如IFN-γ）和Th2細胞因子反應(yīng)（如IL-4），具有很強的佐劑作用。,（二）大腸桿菌不耐熱毒素（LT） 大腸桿菌LT毒素有A和B兩個亞單位，有一定抗原性 A亞單位基因工程點突變體LT(R192G) ——無毒性作用，但仍保留了其佐劑效應(yīng) ——可誘導機體產(chǎn)生局部粘膜免疫反應(yīng)。利用基因突變技術(shù)，構(gòu)建的A和B兩個亞單位的表達質(zhì)粒DNA聯(lián)

43、合應(yīng)用，也可誘導機體產(chǎn)生很強的Th1細胞因子反應(yīng)（IFN-γ）和Th2細胞因子反應(yīng)（IL-4）。而且，LT毒素表達質(zhì)粒作為佐劑，可協(xié)助DNA疫苗誘導機體產(chǎn)生更強的細胞免疫反應(yīng)，有望成為一種新型免疫增強劑。,免疫刺激復(fù)合物（ immunostimulating complex， ISCOM） ISCOM由抗原物質(zhì)與由皂樹皮提取的一種糖苷Quil A和膽固醇按1:1:1混合后自發(fā)形成的一種具有較高免疫活性的脂質(zhì)小泡。 ISCOM直徑

44、40nm，每個ISCOM約含10～12分子的蛋白質(zhì)。 ISCOM應(yīng)用于多種細菌、病毒和寄生蟲病的疫苗，具有產(chǎn)生“全面”免疫應(yīng)答的效力，可長期增強特異性抗體應(yīng)答。 ISCOM能有效地通過粘膜給藥，從而可以用于抗呼吸道感染。 目前，獸用ISCOM疫苗已在國外投放市場。,2、佐劑作用機理： 機理非常復(fù)雜，但可概括三個方面。（不同書有不同寫法） ①抗原儲存庫延長抗原儲存時間，延長抗原釋放，加強抗原降解等； ②形

45、成肉芽腫，促進炎癥反應(yīng)，增強吞噬細胞吞噬作用； ③刺激淋巴細胞增殖和轉(zhuǎn)化。二、佐劑分類 不溶性鋁鹽類佐劑 油水乳劑佐劑 常用佐劑免疫 蜂膠佐劑

46、 細胞因子佐劑 佐劑 微生物及代謝產(chǎn)物佐劑 免疫刺激復(fù)合物（Iscom） 新型免疫佐劑 脂質(zhì)體佐劑（Liposomes） MF59佐劑,,,

47、,一）常用免疫佐劑1、鋁鹽類佐劑 氫氧化鋁膠：主要用于獸用細菌滅活苗（20%乳膠液）2、油水乳劑佐劑油乳佐劑是指一類由油類物質(zhì)和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑。弗氏佐劑：礦物質(zhì)（液體石蠟）、乳化劑（羊毛脂）、卡介 苗組成 的油包水乳化佐劑（三種成分俱全成為弗 氏完全佐劑，不含卡介苗或死結(jié)核桿菌的為弗氏 不完全佐劑）很少用于疫苗，

48、因為太稠，注射困 難，但在實驗中應(yīng)用廣。 礦物油：白油白油佐劑 乳化劑：司苯-80、硬脂酸鋁、吐溫-80 。,,,油乳劑疫苗生產(chǎn)方法見書上55頁。即油乳佐劑和病毒液或菌液按一定比例混合，經(jīng)攪拌（高油）或膠體磨乳化而成油乳劑疫苗：4℃以上保存，不能凍結(jié)，否則易分層即破乳（常溫下保存1年以上，都不分層）。3、蜂膠佐劑（見書）二) 新型免

49、疫佐劑 1、細胞因子類佐劑（相當于胸腺肽、干擾素等因子作用） 干擾素（α、β（抗病毒）γ（免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤）細胞因子 白細胞介素（IL-1、 IL-2、IL-6、IL-12、 IL- 18…IL-21） 腫瘤壞死因子（TFN-α, T

50、FN-β 集落刺激因子,,2、CpG DNA:是含有非甲基化CpG基序的脫氧核糖核酸DNA，能誘生強烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。3、基因工程減毒素：蛋白質(zhì)毒素具有良好的抗原性，所以具有免疫佐劑作用，但不能直接作佐劑需要減毒。4、免疫刺激復(fù)合物（immunostimulating complexes, Iscom）：是由抗原物質(zhì)（20多種病毒的親水蛋白或細菌膜蛋白等）和Quil A（皂樹皮提取的一種糖苷)與膽固醇按