用基因工程的基本操作程序

1、陌陌個性簽名女生文藝控　　1、從云端墜落卻看見整片天空。　　2、Abstruse eyes， a smile in the clear reflections.深邃的眼眸，倒影出笑容的清澈?！　?、左心房旳溫暖，是沵最耀眼旳光芒?！　?、炫麗的彩虹，永遠都在雨過天晴后?！　?、風吹起如花般破碎的流年，而你的笑容搖晃搖晃，成為我命途中最美的點綴，看天、看雪、看季節(jié)深深的暗影?！　?、oО手牽手，一起走進結婚禮堂，讓上帝見證我們的愛情＇★.

2、．　　7、我們的愛，不求生生世世，但求今生今世?！　?、夕陽西下一抹金色映灑滿整個海面，這一刻天和地不再是兩個個體。　　9、╘\＞他和她愛德很美很浪漫就像●/玫瑰花　　10、夏天棄了西瓜愛上了空調　　11、我給你一滴眼淚，你有沒有看到我心中全部的海洋。　　12、詮釋流星的幸福，記錄你我間追逐得ッ雨季~~　　13、伈、為 袮 滴 成 琥 珀， 冷 卻 以 后、 千 哖 后 萬 哖 后、 愛 通 透 依 舊 ?！　?4、摩天輪頂端的幸福..

3、..　　15、午后的微光透過窗簾的間隙投射在泛黃的信紙上，似一塊橘色的琥珀。　　16、心隨你動，時間因你而靜止。,基因工程的基本操作程序,,基因工程基本操作的包括幾個步驟？核心是？,,,,,基因工程基本操作的四個步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構建,3、將目的基因導入受體細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,核心,一、目的基因的獲取,從基因文庫中獲取,利用PCR技術擴增,人工合成,,閱讀教材回答：1、目的基因的來源2、目的基

4、因的種類3、獲取目的基因常用的方法,生物體直接分離,,從基因文庫中獲得目的基因,1、什么是基因文庫？包括的種類有哪些？2、怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢？3、如何構建基因文庫？構建方法包括哪些？4、cDNA文庫和基因組文庫有何不同？嘗試分析出現(xiàn)這些區(qū)別的原因？,①不能轉錄為信使RNA，不能 編碼蛋白質。,：能轉錄相應的信使RNA，能 編碼蛋白質,編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細胞的 基因結構,,,②有調控遺傳信息

5、表達的核 苷酸序列.包括啟動子和終止子,,,,,,,,,非編碼區(qū),,非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,啟動子,終止子,,,,,,,,,2、真核細胞的基因結構,,,,,,編碼區(qū),與RNA聚合酶結合位點,,,內含子,外顯子,能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子,啟動子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,內含子：,外顯子：,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內含子,合作探究：,嘗試畫出真核生物基因表達的過程,

6、,,,DNA,,3、原核細胞與真核細胞的基因結構比較,思考,1、編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？2、cDNA是怎樣獲得的？現(xiàn)在你能理解cDNA文庫的這些特點了嗎？想一想，再與同學交流，還有哪些問題不能理解？,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,基因組DNA文庫,cDNA文庫,基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較,①基因組文庫的構建,（2）基因文庫的構建方法,通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因,② cDNA文庫的構

7、建-----反轉錄法： 以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就叫這種生物的cDNA文庫,比較基因組文庫和cDNA文庫,大,小,有,無,有,無,全部基因,部分基因,部分基因可以,可以,,,怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?,依據(jù)：目的基因的有關信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色體上的

8、位置 基因的轉錄產物mRNA 基因翻譯產物蛋白質等特性,④從基因文庫中得到目的基因的方法,1、構建基因組DNA文庫時，首先應分離細胞的A、染色體DNA   B、線粒體DNAC、總mRNA   D、tRNA,2、目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關基因文庫的描述正確的是A、某生物的全套基因就是一個基因文庫B、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導入某

9、個生物體內，則這個生物就是一個基因文庫C、含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫,A,C,2、利用PCR技術擴增目的基因,閱讀10頁最后一段，結合圖1-8回答：1、PCR的全稱2、概念3、原理4、前提5、條件6、過程,PCR技術—多聚酶鏈式反應,原理：前提：條件：,PCR擴增儀,DNA雙鏈復制的基本原理,一段已知目的基因的核苷酸序列,原料：四種脫氧核苷酸,

10、一對引物（引物1、引物2）,酶：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）,模板：DNA的兩條鏈為模板,能量：溫度控制,：以__ ___方式擴增， 即___ _（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）,指數(shù),2n,方式,使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增,結果,過程,變性、退火、延伸三步曲,變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合延伸：加熱至70～75℃以目的

11、基因為模板，在Taq酶的作用下合成互補的新DNA鏈,重復循環(huán),PCR技術擴增與DNA復制的比較,堿基互補配對,四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復制(PCR擴增儀內),主要在細胞核內,熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）,大量的DNA片段,形成整個DNA分子,解旋酶、普通的DNA聚合酶等,3、人工合成—化學合成法,DNA合成儀,,如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。,

12、1、在遺傳工程中，若有一個控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTG／TACAC，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術進行人工復制，復制時應給予的條件是 ①雙鏈DNA分子為模板 ②ATGTG或TACAC模板鏈 ③四種脫氧核苷酸 ④四種核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥熱穩(wěn)定DNA聚合酶⑦引物 ⑧溫度變化 ⑨恒溫A．①③④⑦⑨ B．①④⑥⑦⑧C．②⑤⑥⑦⑨ D．①③⑥⑦⑧,D,2、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是①從基因文庫中

13、獲取目的基因 ②利用PCR技術擴增目的基因 ③反轉錄法 ④通過DNA合成儀利用化學方法人工合成A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③,D,1）以下說法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 B、質粒是基因工程中唯一的運載體 C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出

14、來,C,3）有關基因工程的敘述中，錯誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來 B、 限制性內切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運載體導入受體細胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內切酶,A,4）有關基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時才用 B、重組質粒的形成在細胞內完成 C

15、、質粒都可作為運載體 D、蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料,D,5）基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因與運載體結合 C、將目的基因導入受體細胞 D、目的基因的檢測和

16、表達,C,二、基因表達載體的構建 ——基因工程的核心,1、目的：所需結構：,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,2、基因表達載體的組成：,、 、 、 等,它們各自的作用是什么?,,質粒,DNA分子,,限制酶處理,,,一個切口兩個黏性末端,兩個切口獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（

17、重組質粒）,,同一種,3.過程:,思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？（P15）,不可以。 因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。 必須構建上述元件的主要理由是：,（1） 生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；,（2） 通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無

18、法轉錄；,（3） 目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；,（4） 為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調控元件，如增強子（增強基因啟動子工作效率的順式作用序列，能夠在相對于啟動子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都發(fā)揮作用。）等；,（5） 有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。,①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標

19、記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構。,注意,②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵。,③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少。,④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。,三、將目的基因導入受體細胞,（一）轉化：,（二）方法,,將目的基因導入植物細胞,將目的基因導入動物細胞,將目的

20、基因導入微生物細胞,,農桿菌轉化法,基因槍法,花粉管通道法,——顯微注射法,——感受態(tài)細胞,目的基因進入_________內，并且在 受體細胞內維持_____和_____的過程,受體細胞,穩(wěn)定,表達,農桿菌轉化法,,1、將目的基因導入植物細胞的方法：（1）農桿菌轉化法 ①農桿菌特點：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力,②原理：Ti質粒上的T---DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的

21、DNA上。,③過程：,④優(yōu)點,（2）基因槍法（3）花粉管通道法,2、將目的基因導入動物細胞①方法：顯微注射法②程序：,目的基因表達載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動物,,,,常用法：Ca2+處理,常用菌：大腸桿菌,微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少,過程：,Ca2+處理大腸桿菌,,感受

22、態(tài)細胞,,表達載體與感受態(tài)細胞混合,,感受態(tài)細胞吸收DNA,3.將目的基因導入微生物細胞,思考：為什么要用Ca2+處理受體細胞？,用Ca2＋處理，增加細菌細胞壁的通透性,四、目的基因的檢測與鑒定,——檢查是否成功,四、目的基因的檢測與鑒定,檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,1、導入檢測,目的：,方法：,DNA分子雜交技術(Southern雜交),從轉基因生物中提取的基因組DNA,探針？,雜交的對象？,用放射性同位素標記的

23、含目的基因的DNA片段,15N,15N,14N,探針,轉基因生物的DNA,變性,變性,,,,,,,14N,,,,過程,①.首先取出轉基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針。③使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中,2、轉錄檢測,目的：,檢測目的基因是否轉錄出了mRNA,方法：,分子雜交技術（Northern雜交）,用放射性同位素標記的含目的基

24、因的DNA片段,探針？,雜交的對象？,從轉基因生物中提取的mRNA.,3、翻譯檢測,目的：,檢測目的基因是否翻譯成蛋白質,方法:,抗原-抗體雜交技術,從轉基因生物中提取的蛋白質,抗原？,抗體？,將目的基因編碼的蛋白質注射進動物體內進行免疫產生的相應抗體,4、個體生物學水平的鑒定,抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,歸納: 基因工程的基本操作程序,獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學方法人工合成構建基因表達載體目的基因、啟動子、終

25、止子、標記基因將目的基因導入受體細胞農桿菌轉化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉錄、翻譯鑒定：,練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構建重組DNA分子所用的限制性內切酶作用于圖中的 處，DNA連接酶作用于 處。（填“a”或“b”）,練習1：(2

26、008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農桿菌轉化法和 法。（3）由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術，該技術的核心是 和 。（4）為了確定耐鹽轉基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的

27、 作探針進行分子雜交檢測，又要用 方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。,答案：（1）a a （2）基因槍法（花粉管通道法）（3）植物組織培養(yǎng)（1分） 脫分化（去分化） 再分化（4）耐鹽基因（目的基因） 一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）,5）基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是

28、 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因與運載體結合 C、將目的基因導入受體細胞 D、目的基因的檢測和表達,C,練習,(四)目的基因的檢測與鑒定,——檢查是否成功,檢測—,鑒定——,,①檢測轉基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA,③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質,抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,

29、方法——,方法——,方法——,DNA分子雜交,分子雜交（注意與上不同之處）,抗原抗體雜交,逆轉錄法,目的基因的mRNA,目的基因,化學合成法,肽鏈氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆轉錄,,,2.基因文庫的構建方法,②人工合成法（真核生物）,,,推測,推測,,單鏈DNA,合成,,①基因組文庫的構建,（2）基因文庫的構建方法,通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因,② cDNA文庫的構建-----反轉錄法：

30、 以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,目的基因的mRNA,單鏈DNA,反轉錄酶,,,DNA聚合酶,雙鏈DNA(目的基因),（一）從基因文庫中直接獲取,按照外源DNA片段的來源：從特定組織提取的染色體基因組DNA ---基因組DNA文庫（總）mRNA反轉錄成的cDNA拷貝----cDNA文庫（部分）,②基因文庫的目的,為了在

31、不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。,①基因文庫的分類,2.基因文庫的構建方法,①：直接分離法,供體細胞中的DNA,許多DNA片段,運載體,限制酶,,,受體細胞,產生特定性狀,導入,外源DNA擴增,,,目的基因,分離,,(鳥槍法),,,多用于原核生物,逆轉錄法,目的基因的mRNA,目的基因,化學合成法,肽鏈氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆轉錄,,,2.基因文庫的構建方法,②人工合成法（真核生