富營養(yǎng)化淺水湖泊太湖中軍團菌屬的分布及多樣性.pdf

1、環(huán)境中常見的致病微生物包括病毒、立克次體、支原體、細菌、真菌等。這些致病微生物廣泛存在于水體、大氣和固體廢棄物如生活垃圾當中,是引起傳染病的罪魁禍首。全球氣候變暖和人類活動加劇了湖泊的富營養(yǎng)化過程,進而可能影響水體中致病微生物的豐度、活性和致病性。目前,致病微生物對于營養(yǎng)鹽濃度變化的響應及其機制的研究開展的較少,還主要集中在部分細菌(如霍亂弧菌)。軍團菌是一種常見的致病微生物,是肺炎型軍團病(Legionnaires’disease)和

2、非肺炎型龐蒂亞克熱(Pontiac fever)的病原體。人們通常是由于呼吸了被軍團菌污染的水源散發(fā)的水霧而傳染上軍團病的。截止目前,已發(fā)現(xiàn)的軍團菌有50多個種,其中近一半與人類疾病有關。有關軍團菌的研究主要集中在人工供水系統(tǒng),如冷卻塔、污水處理廠、配水系統(tǒng)等,以及對感染軍團病病人血清的分析,而對自然環(huán)境水體中軍團菌的分布和多樣性研究以及軍團菌與營養(yǎng)鹽的關系的研究相對較少。
　　 太湖水體富營養(yǎng)化嚴重,不同湖區(qū)存在營養(yǎng)鹽濃度梯度

3、,富營養(yǎng)化對飲用水的安全造成威脅。為了解富營養(yǎng)化淺水湖泊中一種致病微生物軍團菌的存在情況,我們選定典型淺水湖泊太湖為研究對象。為揭示太湖軍團菌種群的組成和多樣性,并探討其與營養(yǎng)水平的關系。我們首先建立了一種快速檢測環(huán)境水樣中軍團菌屬的方法——巢式PCR方法結合MPN(最大可能數(shù))法。隨后,采用該方法分析了太湖不同湖區(qū)32個位點中軍團菌的分布情況,結合變性梯度凝膠電泳(denatured gradientgel electrophores

4、is,DGGE)方法探究了兩種不同生活狀態(tài)的軍團菌(附著細菌和浮游細菌)在太湖不同湖區(qū)的的種群多樣性,通過對軍團菌種群多樣性與環(huán)境因子動態(tài)變化的多元統(tǒng)計分析,揭示各個湖區(qū)中影響軍團菌種群結構的主導環(huán)境因子,探討軍團菌的分布和多樣性與營養(yǎng)鹽的關系。最后通過DGGE典型條帶切膠測序方法,分析不同湖區(qū)中軍團菌的主要種類,了解太湖不同湖區(qū)存在致病軍團菌的風險情況。論文獲得的主要結果如下:
　　 1.建立了巢式PCR結合MPN檢測環(huán)境水體

5、中軍團菌的方法,采用兩對引物擴增環(huán)境樣品的細菌基因組DNA。將檢測到含有軍團菌的樣品DNA模板進行十倍梯度稀釋,由最低檢測的稀釋度,計算出樣品中軍團菌的細胞數(shù),同時確定方法檢測的靈敏度。并用克隆建庫、構建系統(tǒng)樹的方法來驗證本文研究方法的特異性。研究結果表明,巢式PCR后克隆序列均為軍團菌序列,本方法的檢測限為2.74fg/μL軍團菌DNA。
　　 2.運用巢式PCR-MPN法研究軍團菌在太湖不同湖區(qū)的檢出情況,結果顯示,除五里湖

6、浮游樣品外,軍團菌在全湖其他湖區(qū)均有分布,其中北部湖區(qū)(如梅梁湖、貢湖)、東南部湖區(qū)(如南部沿岸區(qū)和東部沿岸區(qū))和湖心區(qū)的檢出率均在20％以上。從2月到11月,軍團菌的檢出率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,最高檢出率出現(xiàn)在8月份的附著細菌樣品中,達到75％,最低檢出率出現(xiàn)在11月份的浮游細菌樣品中,為12.5％。總體而言,軍團菌在附著細菌樣品中檢出率均≥50％,而在浮游細菌樣品中檢出率≥12.5％。配對t檢驗顯示,2月份和11月份的檢出率在兩種

7、生活狀態(tài)的細菌樣品中存在顯著差異,8月份的檢出率存在極顯著差異。
　　 3.采用DGGE分析陽性樣品中軍團菌的基因多樣性,并計算不同湖區(qū)軍團菌的DGGE條帶數(shù)、種群多樣性Shannon-weaver指數(shù)、優(yōu)勢度Simpson指數(shù)和群落均勻度Pielou指數(shù)。結果顯示,附著細菌樣品中貢湖灣和西部沿岸區(qū)軍團菌多樣性最豐富,隨著季節(jié)的變化,DGGE條帶數(shù)一直增加,而Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)和Pielou指數(shù)

8、先減后增,最小值都出現(xiàn)在2月份或者5月份,最大值出現(xiàn)在8月份或者11月份。而浮游細菌樣品中梅梁灣、東太湖和南部沿岸區(qū)多樣性最豐富,季節(jié)變化上,DGGE條帶數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)都呈現(xiàn)先增后減的趨勢,而Pielou指數(shù)一直減少,最大值均出現(xiàn)在5月份,最小值均出現(xiàn)在11月份。
　　 4.對DGGE典型條帶進行切膠回收測序,共獲得68個序列,以97％相似度為依據(jù),獲得的序列可劃分為28個OTUs(Op

9、erational Taxonomic Unit,操作分類單位)。構建細菌的16S rRNA基因的系統(tǒng)進化樹,獲得的序列均屬于軍團菌目,主要為非培養(yǎng)的Legionella spp.,此外,還存在與致病軍團菌種類為Legionella feeleii,Legionella longbeachae,Tatlockia maceachernii和Legionella pneumophila高度相似的序列。
　　 5.在DGGE分析軍團

10、菌群落結構變化的基礎上,采用多元統(tǒng)計學方法研究軍團菌群落組成與環(huán)境因子的相關性,結果表明太湖的營養(yǎng)水平(TN、TP、濁度等)和浮游藻類總生物量是軍團菌種群組成的重要影響因子。因此,太湖軍團菌的組成和多樣性與營養(yǎng)鹽濃度梯度之間有著一定的相關性關系。在營養(yǎng)鹽較高的北部湖區(qū)(梅梁湖、貢湖)和西南部湖區(qū)(西部沿岸區(qū)和南部沿岸區(qū)),軍團菌的檢出率和多樣性均較高。分析溫度變化與軍團菌檢出率的關系結果表明,大部分湖區(qū)在溫度為20℃左右時具有最大的檢出