富營(yíng)養(yǎng)化淺水湖泊太湖中軍團(tuán)菌屬的分布及多樣性.pdf

1、環(huán)境中常見的致病微生物包括病毒、立克次體、支原體、細(xì)菌、真菌等。這些致病微生物廣泛存在于水體、大氣和固體廢棄物如生活垃圾當(dāng)中,是引起傳染病的罪魁禍?zhǔn)?。全球氣候變暖和人類活?dòng)加劇了湖泊的富營(yíng)養(yǎng)化過程,進(jìn)而可能影響水體中致病微生物的豐度、活性和致病性。目前,致病微生物對(duì)于營(yíng)養(yǎng)鹽濃度變化的響應(yīng)及其機(jī)制的研究開展的較少,還主要集中在部分細(xì)菌(如霍亂弧菌)。軍團(tuán)菌是一種常見的致病微生物,是肺炎型軍團(tuán)病(Legionnaires’disease)和

2、非肺炎型龐蒂亞克熱(Pontiac fever)的病原體。人們通常是由于呼吸了被軍團(tuán)菌污染的水源散發(fā)的水霧而傳染上軍團(tuán)病的。截止目前,已發(fā)現(xiàn)的軍團(tuán)菌有50多個(gè)種,其中近一半與人類疾病有關(guān)。有關(guān)軍團(tuán)菌的研究主要集中在人工供水系統(tǒng),如冷卻塔、污水處理廠、配水系統(tǒng)等,以及對(duì)感染軍團(tuán)病病人血清的分析,而對(duì)自然環(huán)境水體中軍團(tuán)菌的分布和多樣性研究以及軍團(tuán)菌與營(yíng)養(yǎng)鹽的關(guān)系的研究相對(duì)較少。
　　 太湖水體富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重,不同湖區(qū)存在營(yíng)養(yǎng)鹽濃度梯度

3、,富營(yíng)養(yǎng)化對(duì)飲用水的安全造成威脅。為了解富營(yíng)養(yǎng)化淺水湖泊中一種致病微生物軍團(tuán)菌的存在情況,我們選定典型淺水湖泊太湖為研究對(duì)象。為揭示太湖軍團(tuán)菌種群的組成和多樣性,并探討其與營(yíng)養(yǎng)水平的關(guān)系。我們首先建立了一種快速檢測(cè)環(huán)境水樣中軍團(tuán)菌屬的方法——巢式PCR方法結(jié)合MPN(最大可能數(shù))法。隨后,采用該方法分析了太湖不同湖區(qū)32個(gè)位點(diǎn)中軍團(tuán)菌的分布情況,結(jié)合變性梯度凝膠電泳(denatured gradientgel electrophores

4、is,DGGE)方法探究了兩種不同生活狀態(tài)的軍團(tuán)菌(附著細(xì)菌和浮游細(xì)菌)在太湖不同湖區(qū)的的種群多樣性,通過對(duì)軍團(tuán)菌種群多樣性與環(huán)境因子動(dòng)態(tài)變化的多元統(tǒng)計(jì)分析,揭示各個(gè)湖區(qū)中影響軍團(tuán)菌種群結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)環(huán)境因子,探討軍團(tuán)菌的分布和多樣性與營(yíng)養(yǎng)鹽的關(guān)系。最后通過DGGE典型條帶切膠測(cè)序方法,分析不同湖區(qū)中軍團(tuán)菌的主要種類,了解太湖不同湖區(qū)存在致病軍團(tuán)菌的風(fēng)險(xiǎn)情況。論文獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.建立了巢式PCR結(jié)合MPN檢測(cè)環(huán)境水體

5、中軍團(tuán)菌的方法,采用兩對(duì)引物擴(kuò)增環(huán)境樣品的細(xì)菌基因組DNA。將檢測(cè)到含有軍團(tuán)菌的樣品DNA模板進(jìn)行十倍梯度稀釋,由最低檢測(cè)的稀釋度,計(jì)算出樣品中軍團(tuán)菌的細(xì)胞數(shù),同時(shí)確定方法檢測(cè)的靈敏度。并用克隆建庫(kù)、構(gòu)建系統(tǒng)樹的方法來驗(yàn)證本文研究方法的特異性。研究結(jié)果表明,巢式PCR后克隆序列均為軍團(tuán)菌序列,本方法的檢測(cè)限為2.74fg/μL軍團(tuán)菌DNA。
　　 2.運(yùn)用巢式PCR-MPN法研究軍團(tuán)菌在太湖不同湖區(qū)的檢出情況,結(jié)果顯示,除五里湖

6、浮游樣品外,軍團(tuán)菌在全湖其他湖區(qū)均有分布,其中北部湖區(qū)(如梅梁湖、貢湖)、東南部湖區(qū)(如南部沿岸區(qū)和東部沿岸區(qū))和湖心區(qū)的檢出率均在20％以上。從2月到11月,軍團(tuán)菌的檢出率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),最高檢出率出現(xiàn)在8月份的附著細(xì)菌樣品中,達(dá)到75％,最低檢出率出現(xiàn)在11月份的浮游細(xì)菌樣品中,為12.5％。總體而言,軍團(tuán)菌在附著細(xì)菌樣品中檢出率均≥50％,而在浮游細(xì)菌樣品中檢出率≥12.5％。配對(duì)t檢驗(yàn)顯示,2月份和11月份的檢出率在兩種

7、生活狀態(tài)的細(xì)菌樣品中存在顯著差異,8月份的檢出率存在極顯著差異。
　　 3.采用DGGE分析陽(yáng)性樣品中軍團(tuán)菌的基因多樣性,并計(jì)算不同湖區(qū)軍團(tuán)菌的DGGE條帶數(shù)、種群多樣性Shannon-weaver指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度Simpson指數(shù)和群落均勻度Pielou指數(shù)。結(jié)果顯示,附著細(xì)菌樣品中貢湖灣和西部沿岸區(qū)軍團(tuán)菌多樣性最豐富,隨著季節(jié)的變化,DGGE條帶數(shù)一直增加,而Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)和Pielou指數(shù)

8、先減后增,最小值都出現(xiàn)在2月份或者5月份,最大值出現(xiàn)在8月份或者11月份。而浮游細(xì)菌樣品中梅梁灣、東太湖和南部沿岸區(qū)多樣性最豐富,季節(jié)變化上,DGGE條帶數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)都呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),而Pielou指數(shù)一直減少,最大值均出現(xiàn)在5月份,最小值均出現(xiàn)在11月份。
　　 4.對(duì)DGGE典型條帶進(jìn)行切膠回收測(cè)序,共獲得68個(gè)序列,以97％相似度為依據(jù),獲得的序列可劃分為28個(gè)OTUs(Op

9、erational Taxonomic Unit,操作分類單位)。構(gòu)建細(xì)菌的16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹,獲得的序列均屬于軍團(tuán)菌目,主要為非培養(yǎng)的Legionella spp.,此外,還存在與致病軍團(tuán)菌種類為L(zhǎng)egionella feeleii,Legionella longbeachae,Tatlockia maceachernii和Legionella pneumophila高度相似的序列。
　　 5.在DGGE分析軍團(tuán)

10、菌群落結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)上,采用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究軍團(tuán)菌群落組成與環(huán)境因子的相關(guān)性,結(jié)果表明太湖的營(yíng)養(yǎng)水平(TN、TP、濁度等)和浮游藻類總生物量是軍團(tuán)菌種群組成的重要影響因子。因此,太湖軍團(tuán)菌的組成和多樣性與營(yíng)養(yǎng)鹽濃度梯度之間有著一定的相關(guān)性關(guān)系。在營(yíng)養(yǎng)鹽較高的北部湖區(qū)(梅梁湖、貢湖)和西南部湖區(qū)(西部沿岸區(qū)和南部沿岸區(qū)),軍團(tuán)菌的檢出率和多樣性均較高。分析溫度變化與軍團(tuán)菌檢出率的關(guān)系結(jié)果表明,大部分湖區(qū)在溫度為20℃左右時(shí)具有最大的檢出