柱子、流動(dòng)相注意事項(xiàng)

1、HPLC使用注意事項(xiàng)及HPLC柱子使用經(jīng)驗(yàn)之談HPLC使用注意事項(xiàng)1.流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細(xì)的膜過濾)。2.流動(dòng)相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。3.不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液。4.使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對(duì)于柱塞桿外部

2、，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上。5.長時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如甲醇等)，因?yàn)榧兯组L霉。6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器。7.C18柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查并清洗。清洗方法；①以異丙醇作溶劑沖洗：②放在異丙醇中間用超聲波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。9.氣泡會(huì)致使壓

3、力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。10.如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗。11.要注意柱子的PH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。12.更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的流動(dòng)相中。更換無互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過渡一下。高效液相色譜常見故障的斷定及解決診狀可能的原因解決方法(一)保留時(shí)間變化1.柱溫變化柱恒溫，必要時(shí)需配置恒溫箱2

4、.等度與梯度間未能充分平衡至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱3.緩沖液容量不夠用》25mmolL的緩沖液4.柱污染每天沖洗柱5.柱內(nèi)條件變化穩(wěn)定進(jìn)樣條件調(diào)節(jié)流動(dòng)相6.柱快達(dá)到壽命采用保護(hù)柱(二)保留時(shí)間縮短1.流速增加檢查泵重新設(shè)定流速2.樣品超載降低樣品量3.鍵合相流失流動(dòng)相PH值保持在3“7.5檢查柱的方向4.流動(dòng)相組成變化防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀5.溫度增加柱恒溫(三)保留時(shí)間延長1.流速下降管路泄漏更換泵密封圈排除泵內(nèi)氣泡2.硅膠柱上

5、活性點(diǎn)變化用流動(dòng)相改性劑如加三乙胺或采用堿至鈍化3.鍵合相流失同前(二)34.流動(dòng)相組成變化同前(二)45.溫度降低同前(二)5(四)出現(xiàn)肩峰或分1.樣品體積過大用流動(dòng)相配樣總的樣品體積小于第一峰的15%佳條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。1、樣品的前處理：a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。c、使用0.45祄的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。2、流動(dòng)相的配制：液相色譜是樣品組分在

6、柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長時(shí)間保留在柱中)。b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，最好使用

7、對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。2、流動(dòng)相流速的選擇：因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.

8、8ml／min為佳。當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。注意：a由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外)。b對(duì)于正相柱推薦使用沸程為3060℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。c含水流動(dòng)相最在實(shí)驗(yàn)前配制，

9、尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長。d流動(dòng)相要求使用0.45祄濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。e使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能HPLC的常用術(shù)語第一部分色譜曲線1、romatogram）：色譜柱流出物通過檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間或流動(dòng)相流出體積的曲線圖，或者通色譜圖（ch過適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ^察到的紙色譜或薄層色譜斑點(diǎn)、譜帶的分布圖。2、（色譜）峰（chr