藥學獸醫(yī)藥理學實驗

1、獸醫(yī)藥理學實驗,山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院主講：劉遠飛,動物醫(yī)學、制藥專業(yè),本課程實驗內(nèi)容,實驗一 藥理實驗基礎知識實驗二  不同給藥途徑對藥物效應的影響實驗三 藥物的協(xié)同作用和拮抗作用實驗四 動物機能狀態(tài)對藥物作用的影響 實驗五 利多卡因和普魯卡因的表面麻醉作用觀察實驗六 藥物敏感性實驗實驗七 磺胺類藥物內(nèi)服給藥后的血中藥物濃度測定實驗八  

2、0;    鏈霉素急性毒性反應及解救實驗九 有機磷酸酯類中毒及解救,實驗一 藥理實驗基礎知識,目的掌握基本操作，鍛煉動手、動腦能力；更好地掌握藥理學基本理論知識；培養(yǎng)科學思維,基本要求 實驗前：預習實驗內(nèi)容并復習相關理論知識； 實驗時 實驗器材要妥善保管； 實驗操作按步驟進行，仔細觀察實驗中出現(xiàn)的現(xiàn)象，實事求是地做好記錄； 注意節(jié)約實驗藥品； 維持良好的課堂紀律。 實

3、驗后各組同學將實驗動物處死，實驗臺擦干凈，將實驗方盤送回準備室；值日生搞好實驗室衛(wèi)生，將死亡動物送至指定場所；書寫實驗報告。,實驗報告的書寫 題目 目的 原理 材料：實驗動物，器材，藥品 方法：用自己的語言簡單扼要描述出來； 結果：要求真實、清楚； 討論：將實驗結果進行比較、分析；實驗中有哪些不足之處；結果異?；蚴〉脑?； 結論：將實驗結果進行歸納總結，應帶有提示性質(zhì)。,實驗設計基本原則隨機原則使每一實驗對象

4、都有同等的機會抽到實驗組或?qū)φ战M中，除處理因素外其他因素盡可能均衡一致，從而抵消非實驗因素的影響。對照原則組間對照：陰性對照，陽性對照，同因素不同水平對照；自身前后對照重復原則,實驗動物動物的選擇 小白鼠：適用于需大量動物的實驗，如某些藥物的篩選，半數(shù)致死量的測定。也較適用于避孕藥實驗、抗炎鎮(zhèn)痛藥實驗、中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥實驗、抗腫瘤藥及抗衰老藥實驗等。 大白鼠：比較適用于抗炎藥物實驗，血壓測定、利膽、利尿藥實驗，也可用于進行亞

5、急性和慢性毒性實驗。,實驗動物動物的選擇 豚鼠：因其對組胺敏感，并易于致敏，故常被選用于抗過敏藥、平喘藥和抗組胺藥的實驗。也常用于離體心臟、心房、腸管實驗。又因它對結核敏感，常用于抗結核病藥的實驗。 家兔：常用于觀察研究腦電生理作用，藥物對小腸的作用。由于家兔體溫變化敏感，也常用于體溫實驗，用于熱原檢查。 狗：狗是記錄血壓，呼吸最常用的大動物。還可利用狗做成胃瘺、腸瘺，以觀察藥物對胃腸蠕動和分泌的影響。在進行慢性毒性實驗時，也常

6、采用狗。,動物捉拿及固定方法小白鼠 右手提起鼠尾, 左手拇指和食指捏住雙耳及頭部皮膚，無名指、小指和掌心夾其背部皮膚及尾部,便可將小鼠完全固定。如圖1。 單手捉持，用拇指和食指抓住小鼠尾巴，用小指、無名指和手掌壓住尾根部，再用騰出的拇指、食指及中指抓住鼠雙耳及頭部皮膚而固定。如圖2。,圖2,圖1,動物捉拿及固定方法豚鼠 豚鼠性情溫和不咬人，用手握住軀干即可。 家兔 可用一手抓住家兔頸背部皮膚，

7、將兔提起，另一手托其臀部，使兔呈坐位姿勢。在進行仰位手術操作時，可用繩帶將其四肢仰位捆綁在兔手術臺上。頭部用兔頭固定夾固定。,動物的給藥方法小白鼠灌胃法（i.g.）：以左手固定小鼠后，使其腹部朝上，頸部伸直。右手持配有灌胃針頭的注射器，自口角插入口腔，再從舌面沿上腭進入食道。小鼠灌胃容量一般為0.1-0.3m1／10g。,動物的給藥方法小白鼠 腹腔注射(i.p.)：以左手固定小鼠，方法同灌胃，右手持注射器，取30度角將針頭從下腹

8、部向頭端刺入腹腔。進針部位不宜過高，刺入不宜太深，以免傷及內(nèi)臟。小鼠腹腔注射量一般為0.1-0.3ml／l0g。,×,√,肌肉注射（i.m.）：小鼠因肌肉較少，很少采用肌肉注射，若有需要可注射于股部肌肉，多選后腿上部外側，一處注射量不超過0.1mL 。,動物的給藥方法小白鼠 皮下注射(s.c.)：用左手固定小鼠后，右手持注射器于拇指和食指捏起的皮膚處進針即可。 靜脈注射(i.v.)：將小鼠置于特制的固定筒內(nèi)或倒置的大漏斗

9、下，讓其尾部露出。用酒精或二甲苯涂擦尾部，或?qū)⑹笪苍?0'C熱水中浸泡半分鐘使血管擴張。左手拉尾端，右手持注射器將針頭刺入尾靜脈，推入藥液。,動物的給藥方法家兔 灌胃：需兩人合作進行。一人取坐位用兩腿夾持兔身，左手握家兔雙耳，右手抓住兩前肢。另一人將木制開口器橫插家兔口內(nèi)，壓住舌頭并固定之。取8號導尿管從開口器中部小孔插入食道。插管時如誤入氣管會出現(xiàn)動物的掙扎和呼吸困難。也可將導尿管的外端浸入水中，如有氣泡吹出，表示插在氣管

10、內(nèi)，此時應拔管重插。當判明導尿管在食道以內(nèi)后，用注射器接通導尿管將藥液推入。,動物的給藥方法家兔 皮下、肌肉、腹腔注射：給藥方法基本上同小鼠，唯針頭可稍大，給藥量可稍多。皮下與肌內(nèi)為0.5-1.0/mg，腹腔為1.0-5.0ml/mg 靜脈注射：將家兔置固定箱內(nèi)，撥去耳殼外緣的毛，選擇一條比較明顯的耳緣靜脈（兔耳外緣的血管為靜脈，中央的血管為動脈，如圖） ，用酒精棉球涂擦皮膚，使血管顯露。用左手拇指和中指捏住兔的耳尖部，食指墊在兔

11、耳注射處的下面，右手持注射器，將針頭從近耳尖處刺入，當確認針頭在血管中后，將藥液推入。,實驗二  不同給藥途徑對藥物效應的影響,實驗目的觀察不同給藥途徑對藥物效應的影響。 實驗材料 l.0ml注射器、針頭、小鼠灌胃針頭、燒杯、普通天平、3.5％硫酸鎂溶液,觀察指標 動物活動增加情況、呼吸急促、反射亢進、震顫、驚厥及死亡時間、炭末推進率等。 實驗方法 取禁食12h的昆明種小鼠3只，稱重，分別標為對照組、灌胃組和

12、腹腔注射組按以下給藥： A：對照組：灌胃給生理鹽水0.2ml/10g； B：灌胃組：灌胃給3.5％硫酸鎂溶液0.2ml/10g； C：腹腔注射組：腹腔注射給3.5％硫酸鎂溶液0.2ml/10g。,給藥后注意觀察動物的活動情況，是否有肌肉松弛的表現(xiàn)。 15min后每只小鼠均灌胃給予5%炭末阿拉伯膠混懸液0.2ml。 炭末灌胃后15min，將小鼠脫臼處死，剖開腹腔，取出胃腸道。剪去附著在腸管上的腸系

13、膜,將腸管不加牽引地輕輕地平鋪在玻璃板上(玻璃板上滴少許鹽水)。以幽門為起點,測量炭末在腸管內(nèi)的移動距離和小腸(自幽門至回盲部)的全長,計算每只小鼠炭末的移動距離占小腸全長百分率，比較3組動物的活動狀況和胃腸炭末推進率有何不同。,實驗結果 實驗結果填入下表中,不同途徑對藥物效應的影響,,思考討論題  灌胃和腹腔注射給硫酸鎂的效應有哪些不同？為什么？本次實驗結果對臨床用藥有何提示？,實驗三 藥物的協(xié)同作用和拮抗作用,目的

14、觀察激動劑與拮抗劑之間的相互作用 材料兔子１只，0.05%硫酸阿托品注射液,0.1%鹽酸腎上腺素注液,0.2%硝酸毛果蕓香堿注射液,方法 取兔放于兔固定箱內(nèi)固定，避免陽光直射眼睛，用毛剪剪去兔兩眼睫毛，然后用瞳孔量尺測量瞳孔大小，連續(xù)三次，取平均值。 在兔左眼滴入０.2%毛果蕓香堿3滴，滴藥時用姆指和食指將下眼瞼提起,使成囊狀,再用中指壓住鼻淚管開口處,防止藥液流入鼻淚管而不起作用，再用右手滴入藥液。15分鐘后再測量瞳孔大小，連

15、續(xù)三次，取平均值，并進行比較。 滴入毛果蕓香堿20分鐘后，分別在兩眼滴入0.1%腎上腺素3滴，15分鐘后測量兩瞳孔大小，連續(xù)3次，取平均值并進行比較。 滴入腎上腺素15分鐘后，分別于兩眼滴入0.05%硫酸阿托品注射液3滴，15分鐘后觀察兩眼瞳孔變化，并測量其大小，連續(xù)3次，并取平均值,記錄,討論題 從實驗結果中如何說明藥物的協(xié)同作用和拮抗作用？,實驗四  動物機能狀態(tài)對藥物作用的影響,實驗目的了解機體在肝、

16、腎功能正?；虍惓r，對某些藥物的作用可能產(chǎn)生影響，從而認識臨床用藥時應該注  意的有關問題。實驗要求掌握小白鼠肝、腎損傷病理模型的制備；掌握它們大體解剖的病理變化。認識動物機能狀態(tài)對藥物體內(nèi)過程的影響，從而引起藥物作用的變化，引申臨床用藥時的注意事項。,實驗儀器、設備儀器：注射器，針頭，天平，鼠籠。藥物：四氯化碳、氯化高汞。濃度與注射劑量？實驗內(nèi)容給健康小白鼠注射四氯化碳，造成肝損傷，后用硫噴妥鈉注射，與健康小白

17、鼠對照， 比較它們麻醉出現(xiàn)及維持的時間的不同；給健康小白鼠注射氯化高汞，造成腎損傷，后用鏈霉素注射， 與健康小白鼠對照，比較它們活動情況的差異；解剖所有小白鼠，分別觀察它們肝和腎的病理變化，并與健康小白鼠比較。,實驗五  利多卡因和普魯卡因的表面麻醉作用觀察,實驗目的了解利多卡因和普魯卡因的表面麻醉作用的差異，認識如何選擇麻醉藥。實驗要求掌握滴眼給藥的方法；在相同的時間點內(nèi)，分別觀察給予兩藥后，左、右眼表面

18、麻醉的情況；結合兩藥的藥理特性對實驗結果進行分析，并了解作為表面麻醉時臨床選藥的依據(jù)。實驗儀器、設備儀器：固定箱，剪刀，滴管。,實驗內(nèi)容取兔1只，放入兔固定箱內(nèi)，剪去睫毛，用兔須觸試角膜表面，觀察并記錄眨眼反射情況。在兔的左眼滴入利多卡因溶液；在右眼滴入普魯卡因溶液。均為1%。在給藥后2、5、10、20、30、40分鐘分別觀察比較兩眼的眨眼反射的差異。,實驗六 藥物敏感性實驗,學習內(nèi)容藥物敏感實驗——紙片法定量藥敏實驗

19、——試管二倍稀釋法學習要求掌握兩種藥物敏感實驗的原理、方法及注意事項。,抗菌藥物敏感性試驗（AST，簡稱藥敏試驗）：用于測試抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑制作用。常用最低抑菌濃度（MIC）表示，即體外能夠抑制細菌生長的最低藥物濃度。通常根據(jù)MIC結合常用劑量時體內(nèi)該藥所能達到的血藥濃度，劃定細菌對各種抗生素敏感或耐藥的界限，給出S（敏感）、I（中介）、R（耐藥）等定性的結果，方便臨床用藥。 檢測病原菌對各種抗生素的敏感性，指導

20、臨床合理用藥。 用于流行病學調(diào)查及院內(nèi)感染的監(jiān)控，控制和預防耐藥菌株的流行。 為經(jīng)驗用藥提供參考依據(jù)。方法：擴散法（紙片法）、稀釋法（有瓊脂稀釋法和液體稀釋法）,藥敏紙片的人工制作定性濾紙用打孔器打成直徑6mm的圓片，每100片放入一小瓶中，160℃干熱滅菌1---2小時，或用高壓滅菌（6.8kg30min）后在60℃條件下烘干。（此應提前做好）抗菌藥物的濃度（指有效藥物濃度）青霉素 200U/ml 其它抗菌藥物 1000ug/

21、ml磺胺類藥物10mg/ml 中草藥制劑 1g/ml慶大霉素4萬單位/ml，稀釋為1000單位/ml。（臨床上可按照藥品使用說明書，如上面標明5克本品可拌50千克飼料，其換算方法為l克本品可拌10千克飼料，也就是1克本品拌l0000克飼料，相當于藥品濃度為l克本品加l0000毫升蒸餾水。）,用無菌操作法將欲測的抗菌藥物溶液1ml，加入100片紙片中，置冰箱內(nèi)1—2小時，用下列方法烘干：培養(yǎng)皿烘干法：將浸有抗菌藥液的紙片攤

22、平在培養(yǎng)皿中，于37℃的溫箱內(nèi)保持2--3小時即可干燥，或放在無菌室內(nèi)過夜干燥。將制好的各種藥物紙片裝入無菌小瓶中，置冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。并用標準敏感菌株做敏感性實驗，記錄抑菌環(huán)的直徑。干燥的藥敏紙片可保存6個月。使用前用標準的敏感菌株做藥物敏感實驗，若抑菌環(huán)比原來小，則表明該紙片已失效。,紙片法每組約7-8個平皿（每人1個），每個平皿約20毫升瓊脂培養(yǎng)基，即約200ml。按照每組500毫升瓊脂培養(yǎng)基、100毫升肉湯培養(yǎng)基準備。每平

23、皿約4張紙片，每班約240張以上。將瓊脂培養(yǎng)基熔融后，每個平皿倒入約20毫升，晾干后，用玻棒蘸含菌棉球（玻棒、棉球均事先消毒）涂抹均勻后晾干。用鑷子夾紙片，每個平皿貼4張紙片，要使紙片全部緊貼培養(yǎng)基。為保證均勻，可于平皿背部劃出貼紙片點。36攝氏度培養(yǎng)過夜。測量寬度。,試管稀釋法每組2排試管，每排10支。共80支。將慶大霉素用肉湯稀釋液成64微克/毫升。每班20毫升即可。挑選10支無菌試管編號1—10。無菌加入1.0毫升肉

24、湯至第2到10管內(nèi)。將64微克/毫升慶大霉素液體，分別加1.0毫升至第1、2管，將第2管混合后取1.0毫升至第3管，依次至第9管，再從第9管取1.0毫升丟去，第10管不加抗生素作陽性對照。,試管稀釋法另準備肉湯管不加抗生素、細菌作陰性對照。第1—10管分別加入已增菌6小時的細菌濃度約為105-106cfu/ml菌液1.0毫升（細菌菌齡為16-18小時，McFarland No 0.5管 細菌濃度1.5×108cfu/ml

25、，然后用用肉湯1：200稀釋）。培養(yǎng)和結果判讀：35℃培養(yǎng)16-24小時，肉眼觀察有無細菌生長。陽性可見混濁生長，陰性可見澄清。最終各試管慶大霉素濃度： 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0 微克/毫升,實驗七 磺胺類藥物內(nèi)服給藥后的血中藥物濃度測定,目的了解磺胺嘧啶非血管內(nèi)一次給藥后血藥濃度隨時間變化的規(guī)律。 原理已知磺胺嘧啶等磺胺類藥物在酸性環(huán)境下其苯環(huán)上的氨基（—NH2）將被離子化而生

26、成銨類化合物（—NH3+）。后者與亞硝酸鈉反應可發(fā)生重氮化反應進而生成重氮鹽（—N＝N+—）。該化合物在堿性條件下可與麝香草酚生成橙黃色化合物。在525nm波長下比色，其光密度與磺胺嘧啶的濃度成正比。,根據(jù)上述原理,在給受試家兔一次靜脈注射一定劑量的磺胺嘧啶后,于不同時間點采集其靜脈血樣,采用比色法對各樣品中磺胺嘧啶的血藥濃度進行定量分析,并以血藥濃度對相應時間作圖,從而獲得磺胺嘧啶的靜脈給藥后的藥時曲。,動物3kg左右家兔一只藥品

27、20％磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、7.5％三氯醋酸、0.1％SD標準液、0.5％亞硝酸鈉、0.5％麝香草酚（用20％NaOH配制）、1000u/mL肝素生理鹽水、3％戊巴比妥鈉、蒸餾水。器材721分光光度計、離心機、磅秤、手術器械、動脈夾、尼龍插管（或玻璃插管、硅膠管）、兔手術臺、注射器（5mL）及針頭、移液器（0.01～1mL）、吸頭、試管、離心管、試管架、玻璃記號筆、藥棉、紗布、計算機。,方法與步驟血中藥物濃

28、度測定麻醉：全麻或局麻均可。取兔一只（實驗前禁食12小時不禁水），記錄體重和性別，耳緣靜脈注射3％戊巴比妥鈉0.8～1.0 mL/kg麻醉，仰位固定于兔手術臺上。手術：頸部手術區(qū)剪毛，切皮約6cm左右，鈍性分離皮下組織和肌肉，氣管插管，分離出頸總動脈約2～3 cm左右，在其下穿兩根細線，結扎遠心端，保留近心端。耳緣靜脈注射1000u/mL肝素1 mL/kg。插管：用動脈夾夾住動脈近心端，再于兩線中間的一段動脈上剪一“V”型切口，

29、插入尼龍管，用線結扎牢固，以備取血用。,方法與步驟血中藥物濃度測定取血：打開動脈夾放取空白血樣0.4mL，分別放入1號管（空白管）和2號管（標準管）各0.2mL搖勻靜置。而后腹腔注射20％SD 1.5mL/kg，分別于注射后5、15、30、45、75、120、180、240、300分鐘時由動脈取血0.2mL加到含有7.5％三氯醋酸2.7mL的試管中搖勻。標準管加入0.1％SD標準液0.1mL，其余各管加蒸餾水0.1mL搖勻。顯色：

30、將上述各管離心5分鐘（1500-2000轉/分），取上清液1.5mL，加0.5％亞硝酸鈉0.5mL，搖勻后，再加入0.5％麝香草酚1mL后溶液為橙色。測定：于分光光度計在525nm波長下測定各樣品管的光密度值。計算血中藥物濃度：根據(jù)同一種溶液濃度與光密度成正比的原理，可用空白血標準管濃度及其光密度值求算出樣品管的磺胺藥物濃度。,結果與處理 將所得數(shù)據(jù)用計算機軟件繪制藥物的藥時曲線。注意事項每次取血前要先將插管中的殘血放掉。

31、每吸取一個血樣時，必須更換吸量管，若只用一支吸量管時必須將其中的殘液用生理鹽水沖凈。將血樣加到三氯醋酸試管中應立即搖勻，否則易出現(xiàn)血凝塊。,實驗八       鏈霉素急性毒性反應及解救,實驗目的觀察鏈霉素對小白鼠的毒性反應，掌握其中毒機理；觀察氯化鈣的對抗作用，掌握其解毒機理。實驗要求加深對抗菌藥物鏈霉素中毒機理的認識；加深對氯化鈣藥理作用的認識，從而認識到氯化鈣作

32、為同類中毒機理引起的中毒的解毒藥的臨床意義。,實驗儀器、設備注射器，針頭藥物：小白鼠腹腔注射鏈霉素。實驗內(nèi)容正常小白鼠六只，分為三組：a組小白鼠兩只，腹腔注射鏈霉素；b組小白鼠兩只，腹腔注射鏈霉素，出現(xiàn)中毒反應后，再腹腔注射氯化鈣，觀察其反應。c組小白鼠兩只，腹腔注射生理鹽水，作對照。觀察各組小白鼠的變化，分析中毒原因及氯化鈣對抗的原理。,實驗九 有機磷酸酯類中毒及解救,實驗目的 有機磷酸酯類中毒的癥狀和血液膽堿酯酶活

33、力的抑制情況。握較阿托品和解磷定解救有機磷酸酯類中毒的作用原理。,實驗原理 有機磷酸酯類中毒后，膽堿酯酶(chE)活性受到抑制，失去水解乙酰膽堿(Ach)的能力，Ach在體內(nèi)蓄積，引起一系列中毒癥狀(M樣、N樣和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀)?？鼓憠A藥阿托品能拮抗Ach的作用，解除有機磷酸酯類中毒M樣癥狀。膽堿酯酶復活藥解磷定能使被有機磷酸酯類抑制的膽堿酯酶活性恢復，對M及N樣癥狀有效。兩藥合用可提高解救效果。,實驗材料實驗動物：家兔，2.5

34、～3.0kg儀器設備：恒溫水浴，分光光度計，試管架，中試管，吸管(0.2ml,lml，2ml，5m1)，濾紙，漏斗，兔盒，注射器(5ml，10m1)，測瞳孔尺，刀片，采血杯，動脈夾，棉球。藥品：0.1％硫酸阿托品(atropine sulfate)，5％敵百蟲(dipterex)，1％肝素(heparin)，2.5％解磷定(pyraloxime methoiodide，PAM)。,實驗方法家兔2只，稱重，觀察并記錄活動情況、呼吸

35、(頻率、有無呼吸困難，呼吸道有無分泌等)、瞳孔大小、唾液分泌、大小便、肌張力及有無肌震顫等。用酒精棉球擦拭兔耳處緣靜脈，當其充血明顯時，用刀片橫斷耳緣靜脈，使血液(0.5～1.0m1)自然流人采血杯(杯內(nèi)預先滴人2滴heparin，自然于燥后備用)中，并輕輕振蕩采血杯，防止凝血。依上述方法取甲乙兩兔耳靜脈血各一份，供測正常膽堿酯酶活性用。分別給甲乙兩兔耳緣靜脈注射5％dipterex 75mg／kg。按前述指標觀察并記錄中毒癥狀。待