載體構(gòu)建流程v3

1、DNA重組技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理、方法和步驟實(shí)驗(yàn)原理1DNA重組技術(shù)重組DNA(RecombinantDNA)技術(shù)是遺傳工程的核心技術(shù)，也是人類在基因和DNA分子水平進(jìn)行操作的技術(shù)。它包括以下幾個(gè)步驟：1）重組DNA分子的構(gòu)建：即將目的基因（DNA或cDNA片段）與載體DNA重組，應(yīng)用TA克隆方法將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物快速克隆至質(zhì)粒載體中。該方法利用了PCR過程中使用的熱穩(wěn)定聚合酶(Taq酶)在所復(fù)制的雙鏈分子末端加上單一脫氧腺苷酸(A)從而產(chǎn)生一A粘

2、性末端的性質(zhì)設(shè)計(jì)一種線性載體使之含有一T粘性末端可直接插入PCR產(chǎn)物在DNA連接酶作用下，目的DNA和載體DNA連接形成重組DNA分子。2）將重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。3）克隆選擇增殖：將轉(zhuǎn)化后的液體涂布于瓊脂培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA（TA克隆載體分子）含有相應(yīng)抗生素的抗性基因，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能在培養(yǎng)基上生長形成集落。挑取菌落，置液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到大量含重組DNA的細(xì)菌。4）收獲擴(kuò)增后的培養(yǎng)細(xì)胞，提取重組

3、DNA分子（質(zhì)粒），并純化，獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝。2質(zhì)粒DNA的小量制備常見的質(zhì)粒DNA提取方法有簡易一步提取法、堿裂解法和煮沸法。本實(shí)驗(yàn)采用的是堿裂解法，堿裂解法的原理：在PH12.0~12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒（CC）DNA仍為自然狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大部分染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而