農藥降解菌施氏假單胞菌YC-YH1的分離鑒定及降解機理研究.pdf

1、有機磷農藥的大量使用在消滅害蟲確保農業(yè)生產的同時，環(huán)境中殘留的農藥給人類健康帶來許多危害?？焖?、有效的清除環(huán)境中的農藥殘留已成為目前研究的熱點。從污染環(huán)境中分離篩選高效降解菌，利用微生物對殘留農藥進行生物降解，是修復農藥污染環(huán)境的重要手段之一。
　　本研究從活性污泥中分離獲得一株毒死蜱高效降解菌YC-YH1，該菌株能夠利用毒死蜱為唯一磷源生長。通過顯微鏡和電鏡掃描觀察確定菌株YC-YH1的形態(tài)特征、結合Biolog微生物鑒定系統(tǒng)和

2、16S rRNA基因序列分子進化分析，鑒定菌株YC-YH1為施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)。利用響應面法研究菌株YC-YH1的最適降解條件，結果表明:菌株YC-YH1的最適降解條件為培養(yǎng)溫度32℃、培養(yǎng)基pH7.3，菌種的初始接種量12.0 mg/L，在優(yōu)化條件下培養(yǎng)4天，可將100 mg/L毒死蜱完全降解。在發(fā)酵條件下，菌株YC-YH1可耐受并降解高達400 mg/L的毒死蜱。降解底物譜分析發(fā)現(xiàn)，YC-YH1對

3、有機磷農藥、擬除蟲菊酯類農藥、多環(huán)芳烴化合物具有一定的降解能力。運用高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術檢測菌株YC-YH1在無磷培養(yǎng)基中降解毒死蜱所產生的代謝產物和生物表面活性劑，推測出可能的代謝途徑和生物表面活性劑的組成成分。
　　本研究采用Illumina Hiseq2000測序平臺對菌株YC-YH1的基因組進行測序，并對基因組數(shù)據(jù)進行生物信息學分析。基因組測序分析表明菌株YC-YH1中同時含有有機磷降解酶基因mpd和ophC2，含有

4、編碼鞭毛、細菌趨化性所需的全部基因，同時含有萘、菲等物質的降解途徑中部分所需酶的基因，這與菌株鑒定和降解特性研究結果相一致。菌株中含有較多的編碼分泌系統(tǒng)蛋白的基因和編碼生物膜組成蛋白的基因，具有特殊代謝能力和生物修復應用潛力。這為研究菌株對外源化合物的代謝途徑及調控網(wǎng)絡提供了研究基礎。
　　熒光差異雙向凝膠電泳分析施氏假單胞菌YC-YH1在毒死蜱誘導條件下的蛋白質表達差異，通過差異比較和統(tǒng)計分析，獲得377個差異蛋白質點，其中11

5、3個差異蛋白質點的豐度上升，264個差異蛋白質點的豐度下降。在脅迫條件下，YC-YH1菌株中含有的有機磷降解酶MPH和OPHC2都是誘導性表達。選擇20個與農藥脅迫相關蛋白的基因進行熒光定量PCR驗證，檢驗其在轉錄水平上的表達情況，驗證結果表明其中有18個基因的表達趨勢與蛋白質組結果相一致，另外2個基因的表達趨勢相反。
　　從菌株YC-YH1的基因組中克隆到42個LysR型調控蛋白的編碼基因，并對這些蛋白進行表達和純化。利用Bia