線粒體的分離

1、1實驗三實驗三線粒體的分離、超活染色與觀察線粒體的分離、超活染色與觀察一、實驗目的一、實驗目的1、學習差速離心法分離動、植物線粒體技術。2、觀察動、植物活細胞內線粒體的形態(tài)、數量與分布。3、學習細胞器的超活染色技術。二、實驗原理二、實驗原理利用沉降系數不同的顆粒，在一定介質中沉降速度的差異，采取分級差速離心的方法，將線粒體從細胞懸液中逐級分離出來。離心用的懸浮介質通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細胞質的分散相，在一定程度上能保持細胞器的

2、結構和酶的活性，在pH7.2的條件下，亞細胞組分不容易重新聚集，有利于分離。整個操作過程應注意使樣品保持4℃，避免酶失活?；铙w染色是指對生活有機體的細胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細胞內的某些結構，而不影響細胞的生命活動和產生任何物理、化學變化以致引起細胞的死亡，可用來研究生活狀態(tài)下的細胞形態(tài)、結構和生理、病理狀態(tài)。體外活體染色又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細胞或組織小塊，以活體染料溶液浸染，染料

3、被選擇固定在活細胞的某種結構上而顯色。詹納斯綠B（JanusgreenB）和中性紅（neutralred）兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對于線粒體的染色各有專一性。線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。詹納斯綠B（JanusgreenB）是對線粒體專一的活細胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。線粒體的細胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現藍綠色從而使線粒體顯色，而胞質中的染料被還原成無色。三、實

4、驗材料與方法三、實驗材料與方法1、材料：人口腔上皮細胞、大鼠肝臟、玉米黃化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋蔥鱗莖內表皮細胞。2、主要試劑和儀器：Ringer溶液，10%、13000中性紅溶液，1%、15000詹納斯綠B溶液；分離介質：0.25molL蔗糖、50mmolL的Tris鹽酸緩沖液（pH7.4），3mmolLEDTA，0.75mgml牛血清白蛋白（BSA），50mmolL的TrisHCl緩沖液(pH7.4)，0.3molL甘露醇

5、（pH7.4）、20%次氯酸鈉（NaClO）溶液、1%詹納斯綠B染液，生理鹽水，0.25molL蔗糖＋0.01molLTris鹽酸緩沖液(pH7.4)，0.34molL蔗糖＋0.01molLTris鹽酸緩沖液(pH7.4)，固定液，姬姆薩染液，115molL磷酸鹽緩沖液（pH6.8）。溫箱，冰箱，冷凍控溫高速離心機（或普通高速離心機），高速離心機，顯微鏡，恒溫水浴鍋，解剖盤，玻璃勻漿器，剪刀、鑷子，雙面刀片，載玻片，凹面載玻片，蓋玻片，

6、漏斗，小燒杯，表面皿，吸管，牙簽，吸水紙，紗布，瓷研缽，尼龍織物。四、實驗方法四、實驗方法（一）大鼠肝線粒體的分離（一）大鼠肝線粒體的分離1、制備大鼠肝細胞勻漿。實驗前大鼠空腹12h，擊頭處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽3分離線粒體分離線粒體混合上清液10000g離心10↓↓↓沉淀（線粒體）上清液（棄去）↓洗滌，加0.25molL預冷蔗糖溶液6mL10000g離心10min重復洗滌兩次↓↓↓沉淀（線粒體）上清液（制一張涂片，后棄去）（二）玉

7、米線粒體的分離（二）玉米線粒體的分離1、玉米種子用20%次氯酸鈉溶液浸泡10min消毒，清水沖洗30min，再浸泡清水15h。將種子平鋪在放有濕紗布的盤內，保持濕度，置溫箱28℃于暗處培育2－3d。待芽長到1－2cm長時剪下下約15g，放0－4℃1h。2、加3倍體積分離介質，在瓷研缽內快速研磨成勻漿。3、用多層紗布過濾，濾液經700g離心10min。除去核和雜質沉淀。4、取上清液10000g離心10min，沉淀為線粒體。再同上離心洗滌一

8、次。5、沉淀為線粒體，可存于0.3molL甘露醇中，注意以上勻漿化及離心均控制在0－4℃進行。6、線粒體的觀察：取線粒體沉淀涂在清潔的載玻片上，不待干立即滴加1%詹納斯綠B染色20min，放上蓋玻片，用顯微鏡觀察，線粒體是藍綠色圓形顆粒。（三）人口腔粘膜上皮細胞線粒體的超活染色觀察（三）人口腔粘膜上皮細胞線粒體的超活染色觀察1、取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴2滴15000詹納斯綠B染液。2、實驗者用牙簽鈍端在自己口腔頰粘

9、膜處稍用力刮取上皮細胞，將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10－15min（注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。3、在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細胞，換高倍鏡或油鏡進行觀察?？梢姳馄綘钌掀ぜ毎暮酥車|中，分布著一些被染成藍綠色的顆粒狀或短棒狀的結構，即是線粒體。（四）洋蔥鱗莖表皮細胞線粒體的超活染色觀察（四）洋蔥鱗莖表皮細胞線粒體的超活染色觀察1、用吸管吸取15