發(fā)育期PFOS暴露的肺損傷效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、胚胎期全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露致SD仔鼠肺損傷及其機(jī)制研究
　　 目的：由于宮內(nèi)PFOS暴露導(dǎo)致的子代死亡風(fēng)險增加可能與PFOS的肺毒性相關(guān)，因此本研究旨在探討胚胎期PFOS暴露致仔鼠肺損傷及可能的毒性機(jī)制。
　　 方法：將雌、雄性成熟SD大鼠按2：1合籠后，經(jīng)陰道涂片篩選受孕的雌鼠。然后將孕鼠隨機(jī)分為對照組（0.05％ Tween-20）、低劑量組（0.1 mg/kg/day PFOS）、高劑量組（2 m

2、g/kg/day PFOS）。從母鼠受孕后第2天（gestational day 1，GD1）開始進(jìn)行PFOS灌胃染毒，直至分娩結(jié)束。染毒體積為1 ml/kg。對出生后的仔鼠觀察其3日內(nèi)存活率及初生至斷奶期間的體重增長情況。同時將初生（PND 0）和斷奶期（PND 21）仔鼠經(jīng)麻醉后處死，收集血液、肺臟等主要臟器。采用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)（LC/MS/MS）分析血清及肺臟組織中PFOS的濃度，用H&E染色法、TUNEL技術(shù)、Real-ti

3、me PCR、western blotting、酶學(xué)技術(shù)等分別檢測肺臟的病理學(xué)改變、肺部細(xì)胞凋亡、細(xì)胞凋亡調(diào)控分子mRNA表達(dá)水平、cyt c蛋白的釋放、caspase 3、8、9的酶活力，同時還檢測了肺臟中MDA水平、GSH的含量以及SOD酶的活力等氧化損傷相關(guān)指標(biāo)。
　　 結(jié)果：與對照組和低劑量組相比，孕鼠妊娠期高劑量PFOS暴露能明顯誘導(dǎo)PND 0和PND 21仔鼠肺臟肺泡出血、肺間隔增厚、炎性浸潤、肺實變等病理學(xué)改變，T

4、UNEL顯示高劑量組仔鼠肺組織出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。胚胎期高劑量PFOS暴露組仔鼠肺臟Bax、Fas以及FasL的mRNA表達(dá)在PND 0和21明顯上調(diào)（P＜0.01），Bcl-2 mRNA水平在PND 0顯著下調(diào)（P＜0.01），而且胞漿cyt c蛋白的釋放水平在PND 0和PND 21均明顯增加（P＜0.01），caspase 3、8、9酶的活力在PND 0和21也顯著提高（P＜0.01）；此外，高劑量組仔鼠肺臟在PN

5、D 0和PND 21 MDA水平明顯增加（P＜0.01）、還原性生物分子GSH的含量顯著減少、抗氧化酶SOD活力下降（P＜0.01）。在低劑量組，仔鼠肺組織中沒有明顯的病理改變和細(xì)胞凋亡，3種caspase酶的活力沒有明顯改變，只是PND 0仔鼠肺臟的bax mRNA表達(dá)和MDA水平，以及PND 21肺臟Fas mRNA表達(dá)會輕微上調(diào)（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：宮內(nèi)PFOS暴露能夠引起仔鼠肺組織的損傷，而且這種損傷具有一定的

6、持續(xù)性。本實驗證實氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞程序性死亡參與了肺組織的損傷過程，而且內(nèi)源性和外源性凋亡通路均被活化。
　　 第二部分、ROS介導(dǎo)的線粒體損傷在PFOS致A549細(xì)胞凋亡中的作用研究
　　 目的：在第一部分的動物研究結(jié)果顯示，氧化損傷和細(xì)胞凋亡在胚胎期PFOS暴露致仔鼠肺損傷中起到了非常重要的作用。但尚不能斷定這些損傷效應(yīng)是PFOS對肺組織的直接毒作用。因此，該部分通過建立體外細(xì)胞染毒模型，探討PFOS對肺上皮細(xì)胞株

7、A549的直接毒效應(yīng)。
　　 方法：通過將A549細(xì)胞在1％血清濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，暴露于不同濃度的PFOS（0、12.5、25、50、100、200 μM）一定時間后，用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、DCFH-DA熒光探針、JC-1熒光探針等分別檢測細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率、胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生以及線粒體膜電位；此外還檢測了MDA水平、GSH含量以及SOD酶活力等氧化應(yīng)激指標(biāo)；用酶學(xué)的方法還檢測了caspase 3、caspase 8、ca

8、spase 9三種酶的活力。此外，還探討了用還原劑NAC預(yù)處理后，通過檢測ROS的產(chǎn)生、細(xì)胞活力和凋亡率，看ROS是否介導(dǎo)了PFOS的毒效應(yīng)。最后，還初步研究了不同血清濃度下（1％和10％）PFOS的毒性差異。
　　 結(jié)果：與溶劑對照組相比，A549細(xì)胞在低血清環(huán)境下（1％）經(jīng)不同濃度的PFOS處理24-72 h后，細(xì)胞活力呈劑量和時間依賴性下降。此外，在該血清濃度下暴露于PFOS，細(xì)胞凋亡率、ROS的產(chǎn)生、MDA水平、SOD酶

9、活力、caspase 3和caspase 9的活力呈劑量依賴性增加，同時，胞內(nèi)GSH含量和線粒體膜電位均下降。但各暴露組細(xì)胞胞內(nèi)caspase 8的活力并沒有上升，甚至在低劑量組還有輕度下降。NAC預(yù)處理能顯著抑制PFOS誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生、細(xì)胞活力下降以及細(xì)胞凋亡。另外，在10％血清濃度培養(yǎng)條件下暴露于PFOS，只有最高劑量組（200 μM）細(xì)胞出現(xiàn)活力下降，而且高血清能顯著抑制200 μM PFOS造成的細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)