血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)

1、血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)原理一實(shí)驗(yàn)原理1、電泳是指帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。在一定pH條件下，不同的質(zhì)點(diǎn)由于具有不同的等電點(diǎn)而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可使它們分離。2、影響電泳遷移率的外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的pH值、溶液的離子強(qiáng)度和電滲現(xiàn)象。3、影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的量、質(zhì)點(diǎn)的大

2、小和形狀。4、采用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法稱為醋酸纖維素薄膜電泳。醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡(jiǎn)便、分辨力高，對(duì)樣品無(wú)拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)。5、醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯，將它溶于有機(jī)溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120μm，有很強(qiáng)的通透性，對(duì)分子移動(dòng)阻力很小。6、本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清蛋

3、白。血清中含有清蛋白、α球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場(chǎng)中的遷移速度不同。以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳，染色后可顯示5條區(qū)帶。其中清蛋白的泳動(dòng)速度最快，其余依次為α1、α2、β及γ球蛋白。二實(shí)驗(yàn)儀器和試劑二實(shí)驗(yàn)儀器和試劑?器材器材醋酸纖維素薄膜（38cm），培養(yǎng)皿，載玻片，電泳儀，電泳槽，粗濾紙，鑷子?材料材料新鮮血清（未溶血）?試劑

4、試劑1、巴比妥緩沖液巴比妥緩沖液（pH8.6，離子強(qiáng)度0.06）：巴比妥1.66g巴比妥鈉12.76g，加水至1000ml。置4℃冰箱保存，備用。（已配置）2、染色液染色液：氨基黑10B0.5g甲醇50ml冰醋酸10ml，蒸餾水40ml，混勻。3、漂洗液漂洗液：含95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸餾水50ml，混勻。4、NaOH溶液：稱取NaOH16g，定容至1000ml。三實(shí)驗(yàn)過(guò)程三實(shí)驗(yàn)過(guò)程一.準(zhǔn)備與點(diǎn)樣準(zhǔn)備與點(diǎn)樣1.將薄膜剪成38

5、cm的小條，在薄膜無(wú)光澤面距一端1.5cm處用鉛筆輕輕劃一條直線，表示點(diǎn)樣位置。?注意醋酸纖維膜的質(zhì)量，至少浸泡10分鐘，浸泡很久仍有大塊白色硬點(diǎn)者須棄之不用。?加樣時(shí)一定要呈直線、垂直、分布均勻，這樣泳動(dòng)的區(qū)帶整齊、不歪。以免影響蛋白質(zhì)區(qū)帶圖譜的完美。?電泳槽兩邊的緩沖液應(yīng)保持液面在同一水平面上，槽里的緩沖液要保持清潔。?電泳電壓大小，時(shí)間長(zhǎng)短與緩沖液的離子強(qiáng)度都有一定的關(guān)系。一般電流約0.4—0.6mAcm電壓110—160V，通電

6、時(shí)間40—60min。電壓高，電流大，電泳速度加快，時(shí)間可縮短，但薄膜上蒸發(fā)嚴(yán)重，因此不能無(wú)限增大電流。?使用比色皿時(shí)要潤(rùn)洗。?染色的同時(shí)也是蛋白質(zhì)的固定，所以，不要將很多蛋白條重疊在一起。?注意薄膜正負(fù)極不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。放的時(shí)候注意血樣不要與濾紙接觸了。?通電完畢時(shí)，必須切斷電源，以防觸電事故。五、失敗圖譜的分析五、失敗圖譜的分析?拖尾狀拖尾狀點(diǎn)樣量過(guò)多，被分離的血清蛋白不能分離成5條區(qū)帶或產(chǎn)生拖尾。?有斑點(diǎn)有斑點(diǎn)點(diǎn)

7、樣不均勻，不整齊，導(dǎo)致被分離的區(qū)帶出現(xiàn)斑點(diǎn)。?邊流現(xiàn)象邊流現(xiàn)象點(diǎn)樣板蘸取血清一邊多一邊少，導(dǎo)致區(qū)帶分離不清，出現(xiàn)邊流現(xiàn)象。?區(qū)帶模糊區(qū)帶模糊薄膜過(guò)濕，樣品擴(kuò)散迅速，導(dǎo)致樣品分離不成區(qū)帶。?鋸齒狀鋸齒狀薄膜用濾紙吸水過(guò)度（薄膜上出現(xiàn)白斑）或點(diǎn)樣過(guò)慢，又未及時(shí)大橋，導(dǎo)致薄膜過(guò)于干燥，使區(qū)帶成鋸齒狀。?區(qū)帶傾斜區(qū)帶傾斜薄膜搭載濾紙上的位置歪斜，彎曲，與電流方向不平行，或點(diǎn)樣一邊多一邊少，區(qū)帶容易泳斜。?顯色過(guò)淺顯色過(guò)淺點(diǎn)樣太少，區(qū)帶顯色不明顯