牛蒡寡糖脂質(zhì)體的制備鑒定以及人a1,6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的初步研究.pdf

1、第一部分的研究內(nèi)容為牛蒡寡糖脂質(zhì)體的制備和鑒定，主要分為牛蒡寡糖含量測定方法的建立、牛蒡寡糖脂質(zhì)體制備工藝及處方研究以及牛蒡寡糖脂質(zhì)體理化性質(zhì)鑒定三個方面的內(nèi)容。
　　 實驗?zāi)康模航⒂嬎闩］蚬烟侵|(zhì)體的包封率的方法，優(yōu)化制備牛蒡寡糖脂質(zhì)體的配方，并對制備好的脂質(zhì)體進行理化性質(zhì)和穩(wěn)定性的研究。
　　 實驗方法：建立葡萄糖濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計算葡萄糖和牛蒡寡糖之間的換算因子來達到對游離牛蒡寡糖的測定，從而實現(xiàn)牛蒡寡糖

2、脂質(zhì)體包封率的計算；繼而選用藥脂比、有機相和水相比例以及磷脂和膽固醇比為考察因素，以包封率為主要考察指標(biāo)設(shè)計正交實驗來優(yōu)化制備處方，并另行考察高壓均質(zhì)條件的優(yōu)化，以此來優(yōu)化牛蒡寡糖脂質(zhì)體的制備方案；再對制備好的牛蒡寡糖脂質(zhì)體進行理化性質(zhì)和穩(wěn)定性研究，包括形態(tài)的觀察、粒徑的測定、zeta電勢的測定、通過包封率的測定研究不同儲存條件下的穩(wěn)定性等。
　　 實驗結(jié)果：葡萄糖濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=12.4051x+0.01428(R=0

3、.99962)，線性范圍為0.005-0.15mg/ml。牛蒡寡糖溶液的換算因子f為1.28。通過截留分子量為30KD的超濾離心管可以對牛蒡寡糖和脂質(zhì)體進行很好的分離。牛蒡寡糖脂質(zhì)體制備最優(yōu)方法為薄膜分散法；制備最優(yōu)條件為：藥脂比1:6，有機相和水相體積比1:2，卵磷脂和膽固醇質(zhì)量比4:1；高壓均質(zhì)最優(yōu)條件為：壓力800bar，循環(huán)數(shù)3。制備好的牛蒡寡糖脂質(zhì)為粒徑均勻的球狀或近球狀小囊泡，平均粒徑為74.2nm，多相分散系數(shù)為0.582

4、，用微電泳儀測得其zeta電勢為-12.56mv，通過測定在常溫和4低溫保存下滲透率的變化確定在4下保存具有較好的穩(wěn)定性。但穩(wěn)定性仍有待改善。
　　 結(jié)論：實驗中成功制備牛蒡寡糖脂質(zhì)體，并對制備工藝、處方以及理化性質(zhì)和穩(wěn)定性作出了研究，該脂質(zhì)體性質(zhì)比較穩(wěn)定，大小均勻，具有較高的包封率，可進行細(xì)胞學(xué)和動物活體實驗，為其臨床及后續(xù)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分的研究內(nèi)容為可溶性的人α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1，6 Fu

5、cT，F(xiàn)UT8)以及對抗該酶的多克隆抗體的初步研究。
　　 實驗?zāi)康模哼\用三種不同的方法來表達可溶性的α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，以用于下游糖蛋白的合成，并為該酶催化和反應(yīng)機制的研究提供底物支持。制備抗FUT8的多抗，為今后開發(fā)癌癥的血清學(xué)診斷試劑打下基礎(chǔ)。
　　 實驗方法：本論文首先從人胃癌細(xì)胞MKN45細(xì)胞株中擴增出FUT8的cDNA，構(gòu)建pET28a-sFUT8載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)進行大量表達。之后對

6、表達得到的包涵體蛋白進行純化、變性和復(fù)性研究，以純化后的包涵體為免疫抗原四次免疫小鼠，制備多克隆抗體，并測定其效價。鑒于原核表達無可溶性目的蛋白獲得，實驗中又嘗試了巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)和體外試劑盒表達α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，實驗將FUT8基因(FUT8)克隆到pPIC9k質(zhì)粒上，電轉(zhuǎn)化入Pichia pastoris GS115菌株，篩選獲得高拷貝的重組菌株，甲醇誘導(dǎo)表達FUT8。同時，我們將構(gòu)建的pET

7、28a-sFUT8載體利用試劑盒在體外進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，利用SDS-PAGE和Western Blot驗證蛋白表達情況。
　　 實驗結(jié)果：實驗從MKN45細(xì)胞株中成功擴增得到FUT8的cDNA，并成功構(gòu)建pET28a-sFUT8原核載體，原核表達獲得FUT8的包涵體蛋白。我們利用純化后的包涵體進行了多抗制備，得到效價在1:5000至1:10000之間的抗FUT8多抗，為癌癥的血清學(xué)診斷試劑研究打下了基礎(chǔ)。同時我們成功構(gòu)建pPIC9

8、k-FUT8真核表達載體，可溶性FUT8蛋白在畢赤酵母中成功表達。另外，pET28a-sFUT8載體在體外成功表達，得到了可溶性的FUT8蛋白，SDS-PAGE和Western Blot都驗證蛋白成功表達。
　　 結(jié)論：本實驗室成功構(gòu)建了pET28a-sFUT8原核載體和pPIC9k-FUT8真核載體，并將其分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌和畢赤酵母內(nèi)進行表達，得到的FUT8目的蛋白。原核表達得到包涵體蛋白，真核表達和試劑盒體外表達都得到少量