DEHP胚胎期暴露對大鼠子代神經(jīng)行為發(fā)育的影響及機制研究.pdf

1、前言：鄰苯二甲酸二乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate,簡稱DEHP),屬于鄰苯二甲酸酯類化合物(phthalic acid esters,PAE)中的重要成員,是塑料工業(yè)最主要的增塑劑之一。隨著DEHP產(chǎn)量的逐年增加,其在環(huán)境中的濃度也逐漸升高,對人體的毒性作用也越來越受到關(guān)注,國內(nèi)外許多國家已經(jīng)開始重視對DEHP的毒性研究、危險度評價及安全性監(jiān)控。
　　 目前對DEHP的神經(jīng)毒性及其機制的系統(tǒng)報道較少

2、而且尚無明確的結(jié)論。有研究證明DEHP孕期染毒使新生大鼠下丘腦視前交叉區(qū)芳香化酶(aromatase)表達減低,并對其活性產(chǎn)生影響。芳香化酶是神經(jīng)類固醇脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)及硫酸酯(Dhea sulfuric acid ester,DHEAS)和睪酮合成代謝的重要輔酶。DHEA及DHEAS和睪酮均對神經(jīng)系統(tǒng)有著重要保護作用。因此,DEHP導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機制可能是通過影響芳香化酶開始的。

3、
　　 人類可廣泛暴露于鄰苯二甲酸酯類物質(zhì),其中婦女因使用含鄰苯二甲酸的化妝品和個人護理用品成為鄰苯二甲酸酯的高危人群,DEHP可以通過胎盤屏障進入胎兒體內(nèi),在胎兒體內(nèi)聚集,也可直接作用于胎兒。但如果在孕期接觸DEHP,由于胎兒的血腦屏障尚未發(fā)育完成,DEHP可能通過胎盤進入胎兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng),從而影響到子代的腦發(fā)育。因此,本研究擬通過大鼠孕期暴露DEHP建立子代大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷的動物模型,通過觀察DEHP所致子鼠行為畸胎學(xué)、神

4、經(jīng)行為學(xué)相關(guān)指標的變化,評價DEHP與子代神經(jīng)系統(tǒng)損傷的關(guān)聯(lián)。另外,通過DEHP對神經(jīng)類固醇代謝酶類固醇急性調(diào)控蛋白(Steroids acute controlprotein,STAR)和細胞色素P450基因(cytochorme P450 gene,CYP19a1)mRNA水平及海馬神經(jīng)元凋亡及凋亡相關(guān)蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(B celllymphoma/leukemia-2 genes,bcl-2),bcl-2相關(guān)蛋白(

5、bcl-2 associated X protein,bax)mRNA水平的影響,探討DEHP可能的發(fā)育神經(jīng)毒性機制,進而為DEHP安全性評價、危險度評估及DEHP環(huán)境污染的監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗動物分組及染毒清潔級Wistar大鼠雌性28只,體重220-250g,由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按體重隨機分為4組:對照組和低、中、高劑量組,每組7只。動物交配∶雌雄大鼠以1

6、∶1同籠,次日晨于盤底及陰道檢查陰栓,查出陰栓者,記為妊娠1天,母鼠編號稱重,另籠飼養(yǎng),同時進行如下處理。對照組:用玉米油灌胃;低劑量組(10 mg/kg/d DEHP):用含0.1％DEHP的玉米油溶液灌胃;中劑量組(100 mg/kg/d DEHP);用含1.O％DEHP的玉米油灌胃；高劑量組(500mg/kg/d DEHP):用含5％DEHP的玉米油溶液灌胃。實驗各組動物自由飲水,連續(xù)染毒19天至子鼠出生。每7天稱重1次。動物室溫

7、度18-23℃,相對濕度45-55％,染毒結(jié)束后進行各種指標測定。
　　 二、觀察指標及檢測方法
　　 1、行為畸胎學(xué)指標的測定
　　 2、神經(jīng)行為學(xué)指標的測定
　　 (1)水迷宮試驗
　　 (2)電穿梭試驗
　　 3、海馬組織病理切片細胞形態(tài)的觀察:HE染色
　　 4、海馬組織細胞凋亡指標的測定
　　 (1)海馬組織細胞凋亡率的測定
　　 (2)凋亡相關(guān)基因bcl

8、-2和bax mRNA水平的測定5、STAR和CYPl9al mRNA水平的測定
　　 三、數(shù)據(jù)處理采用EXCEL數(shù)據(jù)庫錄用數(shù)據(jù),SPSS16.0進行實驗數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)統(tǒng)計描述主要以x±s形式表示。根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性,進行單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗,LSD進行多重比較。檢驗水準a=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 一、行為畸胎學(xué)指標的測定負趨地性反射實驗500 mg/ke/d

9、 DEHP組與對照組相比,達標時間延遲,經(jīng)方差分析,其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=42.341;P=0.001)?？罩蟹龑嶒?00mg/kg/dDEHP組、500mg/kg/d DEHP組與對照組相比,達標時間延遲,經(jīng)方差分析,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(100mg/kg/d DEHP組F=4.713,P=0.049;500 mg/kg/d DEHP組F=5.006,P=0.043)。
　　 二、神經(jīng)行為學(xué)指標的測定
　　 (一)

10、DEHP不同劑量染毒對子鼠水迷宮試驗參數(shù)的影響水迷宮測試時,DEHP各劑量組與對照組相比,無論錯誤次數(shù)還是潛伏期差別均有統(tǒng)計學(xué)意義,10mg/kg/d、100mg/kg/d和500mg/kg/d DEHP組與對照組相比,潛伏期延長(F=11.221；P=0.000)；100mg/kg/d和500mg/kg/d DEHP組與對照組相比,錯誤次數(shù)增加(F=8.058；P=0.000)。
　　 (二)DEHP不同劑量染毒對子鼠電穿梭試

11、驗參數(shù)的影響穿梭測試時,DEHP各劑量組與對照組相比,電擊次數(shù)、主動逃避時間均有統(tǒng)計學(xué)意義,100mg/kg/d和500mg/kedd DEHP組與對照組相比,電擊次數(shù)增加,(F=6.984；P=0.000);10mg/kg/d、100mg/kg/d和500mg/kg/d DEHP組與對照組相比,主動逃避時間延長(F=9.841；P=0.000)。
　　 三、海馬組織病理切片細胞形態(tài)的觀察將出生后7天的大鼠取海馬組織,制成標本,

12、光鏡觀察發(fā)現(xiàn),10mg/kg/d、100mg/kg/d、500mg/kg/d劑量組海馬組織中神經(jīng)元細胞形態(tài)與對照組基本表現(xiàn)一致;500mg/kg/d高劑量組排列略顯混亂,未見明顯的病理學(xué)改變。
　　 四、海馬組織細胞凋亡率的測定出生后7天子代大鼠的海馬神經(jīng)元細胞凋亡率要明顯高于出生后21天,且出生后7天時,隨著DEHP染毒劑量的增加,子代大鼠海馬神經(jīng)元的細胞凋亡率有一定的上升趨勢。
　　 五、凋亡相關(guān)基因bcl-2和ba

13、x的測定不同劑量的DEHP染毒對海馬體bcl-2和bax的基因表達產(chǎn)生影響。隨著DEHP染毒劑量由低到高,bcl-2和bax基因擴增產(chǎn)物在凝膠中顯示的條帶由暗到亮,出現(xiàn)一定的劑量關(guān)系,尤其高劑量組與對照組目的基因表達條帶的明暗對比更為顯著,相對而言,半定量分析后bax的mRNA水平高于bcl-2。
　　 六、STAR和CYP19a1基因表達的測定DEHP不同劑量染毒對海馬組織STAR基因表達的影響并不明顯。DEHP不同劑量染毒對

14、海馬組織CYP19a1基因表達產(chǎn)生影響。隨著DEHP染毒劑量由低到高,CYP19a1基因擴增產(chǎn)物在凝膠中顯示的條帶由亮到暗,出現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系,尤其是500mg/kg/d劑量組與對照組相比,CYP19al基因mRNA水平降低明顯。
　　 結(jié)論：本研究采用整體試驗動物的方法,通過DEHP胚胎期暴露對大鼠子代神經(jīng)行為發(fā)育的影響及其相關(guān)指標檢測,得出如下研究結(jié)論:
　　 1、DEHP胚胎期暴露對子鼠的神經(jīng)行為的發(fā)育有負面影

15、響。
　　 2、DEHP胚胎期暴露可使出生后7天子鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡率增加。
　　 3、DEHP胚胎期暴露可使出生后7天子鼠海馬組織凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax的表達改變,使bcl-2/bax的比值減小,提示細胞凋亡的增加。
　　 4、隨著DEHP胚胎期暴露劑量的增加,海馬神經(jīng)元CYPl9a1tuRNA水平降低,STAR基因的表達無明顯變化。提示DEHP降低芳香化酶表達從而干擾神經(jīng)類固醇合成代謝。