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1、諾如病毒研究進(jìn)展及一起郵輪諾如病毒感染疫情的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),上海國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心實(shí)驗(yàn)室 章琪 方筠 王家棟 Tel:021-62688086 Email: zhangq@shciq.gov.cn,食源性急性胃腸炎綜述諾如病毒介紹案例介紹(一起郵輪諾如病毒感染疫情的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)),第一部分:食源性急性胃腸炎綜述,食源性急性胃腸炎流行現(xiàn)狀,
2、Source: Foodborne Outbreak Reporting System http://www.cdc.gov/foodborneoutbreaks/,主要病原體:,毒素介導(dǎo)(Toxin-mediated): 水樣便 病毒:諾如,輪狀,星狀,腺病毒 細(xì)菌: 蠟樣芽孢桿菌 ,產(chǎn)氣莢膜梭菌,金黃色葡萄球菌 ,產(chǎn)腸毒素
3、 型大腸桿菌侵襲性病原體(Invasive microbes) :膿血便 細(xì)菌:大腸桿菌(侵襲性、致病性、出血性),沙門氏菌,空腸彎曲 桿菌,志賀氏菌,艱難梭菌 原蟲:賈第鞭毛蟲,溶組織內(nèi)阿米巴滲透性病原體(Penetrating microbes): 系統(tǒng)感染 細(xì)菌:傷寒、副傷寒沙門氏菌,鼠疫桿菌,感染途徑:,病人接觸:諾如病毒、志賀氏菌、出血性大腸桿菌旅
4、行:大腸桿菌、沙門氏菌、賈第鞭毛蟲 郵輪:諾如病毒(Cruise-ship virus)動(dòng)物接觸:沙門氏菌,出血性大腸桿菌,賈第鞭毛蟲疫水:隱孢子蟲,出血性大腸桿菌污染的食物:沙門氏菌,致病性:,感染劑量:(病原體顆粒數(shù))隱孢子蟲:10-100志賀氏菌:10-100出血性大腸桿菌:10-100空腸彎曲桿菌:104–106沙門氏菌:105–108霍亂弧菌:105–108產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌:108鼠疫
5、桿菌:109,Slutsker L, et al. Ann Intern Med 1997; 126:505-13,食源性急性胃腸炎的防控仍然是很大的挑戰(zhàn)!,諾如病毒:10-100,第二部分:諾如病毒介紹,歷史:,In 1929, Zahorsky proposed the name “winter vomiting disease” to describes outbreaks of presumed viral gastro
6、enteritis In the 1940s, Gordon demonstrated that pooled stool filtrates obtained from patients in an institutional outbreak of nonbacterial gastroenteritis could infect inoculated volunteersIn 1968, CDC investi
7、gated an outbreak of vomiting disease in an elementary school in Norwalk OH: 50% of students and teachers developed gastroenteritisKaplan used immune electronmicroscopy to identify viral particles in the sto
8、ols of volunteers infected with the “Norwalk” strainVirus initially classified as small round viruses, later reclassified as caliciviruses when genome cloned, Dr. Albert Kapikian 1972, electron
9、microscopy Small Round-Structured Virus (SRSV) 27 nm,Kapikian AZ, et al. Visualization by immune electron microscopy of a 27-nm particle associated with acute infectious nonbacterial gastroenteritis
10、. J Virol, 1972, 10 (5): 1075-1081.,美國(guó)2006年諾如病毒引起的急性胃腸炎數(shù)量,流行現(xiàn)狀:,自1995年我國(guó)報(bào)道首例諾如病毒感染以來,近年來在我國(guó)已有多起諾如病毒引起的急性胃腸炎暴發(fā)疫情的報(bào)道 : 韓健康,沈建勇,姚文庭,等.一起諾如病毒Ⅰ型Ⅱ型混合感染急性胃腸炎暴發(fā)疫情調(diào)查分析.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2008,22(4): 263-265程慧健,袁輝,熊英,等.一起諾如病毒感染性腹瀉暴發(fā)的
11、調(diào)查.中華流行病學(xué)雜志,2008,29(6):627-628鐘培松,王韶華,陳時(shí)千,等. 一起福利院諾瓦克病毒胃腸炎暴發(fā)調(diào)查.中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2007,8(5):621-623林玫,劉巍,梁大斌,等. 諾如病毒引起的感染性腹瀉暴發(fā)疫情調(diào)查.應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2007,13(1):11-14,我國(guó)流行現(xiàn)狀,1996年和1997年分別在北京和太原開展的人群血清標(biāo)本中的諾瓦克樣病毒特異性IgG抗體檢測(cè)表明,北京市諾瓦克樣病毒抗體總檢出率為8
12、8.8%以上。太原市總檢出率在78.6%以上。 1998-2002在福州地區(qū)用RT-PCR方法對(duì)288份腹瀉患者糞便標(biāo)本諾瓦克樣病毒病原檢測(cè)顯示,諾瓦克樣病毒基因組I的陽(yáng)性率為11.1%,主要是7歲以上兒童及成人;諾瓦克樣病毒基因組Ⅱ的陽(yáng)性率為 28.8%,主要是6月齡至3歲嬰幼兒。,我國(guó)流行現(xiàn)狀,基本特征:,發(fā)病率高、致病劑量低、抵抗力強(qiáng),被WHO定為B類病原體;對(duì)加熱、低溫具有較強(qiáng)抵抗性(能耐受零度以下到60℃)
13、;對(duì)酸堿和去污劑等具有較強(qiáng)的抵抗性 (通常10ppm或10mg/L含氯去污劑處理30分鐘不能有效殺滅病原體);無法培養(yǎng),無有效小動(dòng)物模型;型別眾多,無有效保護(hù)性抗體,常引起重復(fù)感染;復(fù)制機(jī)制還不清楚,無有效治療藥物及疫苗,病原學(xué):,TaxonomyFamily Caliciviridae Genus:1. Norwalk-Like Viruses (NLVs)2. Sapporo-Like Viruse
14、s (SLVs)Genus Noroviruses(formerly Norwalk-Like Viruses)Genus Lagovirus (rabbit, hare)Genus Vesivirus (cat, pig, sea lion, other)Genus Norovirus (human, bovine, swine, mouse)Genus Sapovirus (human, swine),Viri
15、ons ( 35 -40 nm ) nonenveloped and icosahedral,Genome structure:Linear positive sense RNA of 7.4 - 7.7 kb,,,,,,,,5',3',Hel,Pro,Pol,ORF 1,ORF 2,ORF 3,1,5,5358,5374,6950,6950,7588,7654,1789,530,212,,Capsid,Source:
16、 GenBank M87661,Clusters differ by ≥ 20% amino acid pairwise distanceGenogroups differ by 44-55% amino acid pairwise distance,病毒的分型(Capsid protein),1,病毒培養(yǎng):,Cell culture: no (human strains)Animal model: no (chimpanzees)
17、,流行現(xiàn)狀:Causes an estimated 23 million infections per year in the USCauses ~60% of illness due to knownAccounts for 70-95% of gastroenteritis outbreaks感染劑量: 10-100 viruses:傳播途徑: Fecal-oral transmission (she
18、dding for up to 2-3 weeks) Droplet transmission? (via ingestion of airborne droplets of virus containing particles) Common cause of traveler’s diarrhea May cause chronic infecti
19、on in transplant recipients,流行病學(xué):,傳播途徑:,糞-口傳播 Person-to-person Foodborne Waterborne Mixed空氣傳播 Vomitus污染物,傳播途徑分類:,臨床癥狀:,腹瀉86%嘔吐78%腹部疼痛或絞痛 30%惡心(無嘔吐) 15%嗜睡
20、8%發(fā)熱7%肌肉疼痛7%頭痛6%頭暈4%脫水4%寒顫3%喉嚨疼痛1%鼻出血1%,感染持續(xù)過程:,病毒顆粒持續(xù)釋放過程:,診斷:,急性胃腸炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(美國(guó)CDC標(biāo)準(zhǔn)): 腹瀉等于3次或者多于3次不成形糞便/24h;嘔吐伴隨一種以下癥狀如:1次或多次不成形便24/h、胃部不適、頭疼、肌肉疼痛和發(fā)燒。郵輪疫情的定義:感染者通?!?%郵輪總
21、人數(shù)。,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),(一)抗原檢測(cè)1972年首先通過免疫電鏡的方法發(fā)現(xiàn)NVs,因此該方法在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)成為檢測(cè)NVs的經(jīng)典方法。電鏡法包括常規(guī)電鏡(EM)、免疫電鏡(IEM)以及固相免疫電鏡(SPIEM)三種。直接電鏡法通過將糞便標(biāo)本重懸后離心,負(fù)染病毒顆粒后直接在鏡下觀察來尋找病毒。由于NVs病毒顆粒并不具備典型的杯狀病毒特征,且糞便中病毒滴度通常較低,給直接電鏡觀察帶來了很大困難,通常要求病毒的滴度達(dá)到106/g才能達(dá)到檢測(cè)
22、要求。免疫電鏡的方法是將重懸離心分離得到的病毒顆粒與標(biāo)準(zhǔn)血清共孵育后再經(jīng)負(fù)染后在鏡下觀察來檢測(cè)病毒。盡管這種方法可以較好地濃縮病毒顆粒,但靈敏度仍然較低,對(duì)NVs檢測(cè)的陽(yáng)性率只有20%左右。固相免疫電鏡的方法是將特異性抗體直接包被載網(wǎng),同時(shí)加入蛋白A增加抗體與標(biāo)本中抗原結(jié)合的機(jī)會(huì),從而提高檢測(cè)的靈敏度。上述三種方法都要求觀察者具有豐富的經(jīng)驗(yàn),同時(shí),精密的檢測(cè)儀器、較大的勞動(dòng)強(qiáng)度,都制約了該方法在NVs檢測(cè)中的應(yīng)用。,免疫學(xué)檢測(cè)(EIA)
23、主要通過檢測(cè)標(biāo)本中的抗原來確認(rèn)諾如病毒。該方法操作簡(jiǎn)單,實(shí)用性較強(qiáng),便于推廣。然而同樣由于NVs型別的多樣性,對(duì)該方法的應(yīng)用產(chǎn)生了限制。 Bruin等在2006年首次報(bào)告了對(duì)兩種新上市的商品化NVs EIA檢測(cè)試劑盒的評(píng)估結(jié)果。結(jié)果表明,與傳統(tǒng)的RT-PCR方法相比,IDEIA和Ridascreen這兩個(gè)品牌的試劑盒對(duì)NVs的檢測(cè)靈敏度分別為38%和36%,特異性為96%和88%。之后的兩項(xiàng)評(píng)估結(jié)果雖然有提高,但靈
24、敏度也僅在60.%?76.9%和59%?80.3%之間。表明盡管對(duì)單個(gè)樣品的診斷可能還存在問題,但可應(yīng)用于NVs大規(guī)模暴發(fā)后的篩查。,(二)核酸檢測(cè),逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR):除了能更準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)標(biāo)本中的諾瓦克病毒,尤其是低濃度的諾瓦克病毒感染外,最大的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)一步對(duì)病毒進(jìn)行血清型和基因型的研究,不會(huì)受到獲得分型單克隆抗體的限制,對(duì)流行病學(xué)研究具有重要意義,是諾如病毒檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。,Specimen Proces
25、sing (Faeces)Viral Recovery & RNA extractionGenerate cDNA from RNA by reverse transcriptionPCRNorovirus Genogroup I or II identified SequencingGenotyping,,,,,,實(shí)驗(yàn)流程:,,第三部分 一起郵輪諾如病毒感染疫 情的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),基本情況介紹,20
26、08年11月4日, 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局接某大型郵輪報(bào)告,該船載有乘客2664人,乘務(wù)人員1087人,自10月22日從泰國(guó)曼谷起航后,船上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)急性胃腸炎感染病例。感染人數(shù)在11月2日和3日達(dá)到高峰,至11月4日已達(dá)285人(截止11月6日符合急性胃腸炎癥狀的病例達(dá)368人)。上海出入境檢驗(yàn)檢疫局在接到報(bào)告后迅速啟動(dòng)緊急預(yù)案,多個(gè)部門通力合作,開展現(xiàn)場(chǎng)檢疫查驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查,明確事件性質(zhì);實(shí)驗(yàn)室迅速開展急性胃腸炎相關(guān)病原的快速檢測(cè),在
27、收到樣品后3小時(shí)就初步確認(rèn)引起這次大規(guī)模急性胃腸炎的病原為諾如病毒。這是檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)首次在口岸確診大規(guī)模諾如病毒暴發(fā)疫情。,,Unpublished results by Wang J. and Zhang Z.,實(shí)驗(yàn)室診斷處置依據(jù):,《上海國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心腹瀉病處置預(yù)案》,診斷原則,首先排除檢疫傳染病(霍亂)流行病學(xué)調(diào)查資料臨床癥狀其它相關(guān)資料,,確定檢測(cè)項(xiàng)目,檢測(cè)方法,排查方案(一),(一)輪狀病毒:1. 金標(biāo)法檢測(cè)輪狀
28、病毒抗原試劑:糞便輪狀病毒檢測(cè)試劑盒;試劑廠家:法國(guó)VEDA公司;樣本:糞便;時(shí)間:30分鐘。2.ELISA法試劑:輪狀病毒酶免檢測(cè)試劑盒;供應(yīng)商:上海軒昊科技發(fā)展有限公司樣本:糞便;時(shí)間:2小時(shí)。3.熒光定量RT-PCR法試劑:輪狀病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒;單位:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所;樣本:糞便;時(shí)間:4小時(shí)。(二)諾如病毒1.ELISA法檢測(cè)病毒抗原試劑:Enzyme i
29、mmunoassay for the detection of Norovirus in stool samples;廠家:R-Biopharm AG;樣本:糞便;時(shí)間:4小時(shí)。2.半定量RT-PCR法(本實(shí)驗(yàn)室)樣本:糞便;時(shí)間:6小時(shí)。,排查方案(二),結(jié)果:,ELISA檢測(cè)結(jié)果:,RT-PCR檢測(cè)結(jié)果:,TIPS: for sample cellection1.最好采集水樣便或稀便;2.最好采集發(fā)病48-72小時(shí)之
30、間的糞便樣本;3. 直腸拭子或嘔吐物標(biāo)本一般作參考,電鏡病毒顆粒觀察結(jié)果,磷鎢酸負(fù)染,40,000? 電鏡觀察,檢測(cè)過程總結(jié):,諾如病毒進(jìn)一步研究方向:,快速檢測(cè)方法:Latex, LAMP,NASBA?分子流行病學(xué):陸地—海洋循環(huán)進(jìn)化規(guī)律消殺試劑,本次疫情處置的經(jīng)驗(yàn)得失:,我國(guó)口岸首例,成功處置,找到病原體;鍛煉了隊(duì)伍,增強(qiáng)了職責(zé)、使命感,強(qiáng)化了疫情的觀念;為口岸衛(wèi)生檢疫科研的開展、技術(shù)的儲(chǔ)備明確了方向;各項(xiàng)細(xì)節(jié)有待完善,
31、郵輪突發(fā)傳染病疫情相關(guān)動(dòng)向:,軍團(tuán)菌: Legionella species colonization of water distribution systems, pools and air conditioning systems in cruise ships and ferries. BMC Public Health. 2008,8:390. 流感病毒: A large outbreak of influ
32、enza A and B on a cruise ship causing widespread morbidity. Epidemiol Infect. 2003,130(2):263-71. Large summertime influenza A outbreak among tourists in Alaska and the Yukon Territory. Clin Infect Dis. 2003,36(9)
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