轉(zhuǎn)化生長因子-β3調(diào)控循環(huán)纖維細(xì)胞在放射性肺纖維化中的作用研究.pdf

1、目的意義:放射性肺纖維化是臨床胸部腫瘤放療常見的并發(fā)癥之一，也可發(fā)生于骨髓移植手術(shù)前的放療預(yù)處理及其它意外照射，其主要特征為肺臟內(nèi)纖維結(jié)締組織增多，實質(zhì)細(xì)胞減少，持續(xù)進(jìn)展可致肺臟結(jié)構(gòu)破壞和功能減退，乃至肺功能衰竭，嚴(yán)重威脅人類健康和生命。臨床上放射性肺纖維化缺乏特異、有效的治療措施，患者預(yù)后較差。因此研究并闡明放射性肺纖維化發(fā)生的規(guī)律與特征和分子機制，對于臨床上預(yù)測放射性肺纖維化的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸，尋找干預(yù)、治療的手段有著極其重要的意義。研究

2、表明，轉(zhuǎn)化生長因子β-1(transforming growth factor-β，TGF-β1)是重要的促纖維化因子之一，在肺纖維化過程中調(diào)控成纖維細(xì)胞分裂、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，促進(jìn)纖維化的發(fā)生。然而TGF-β3在組織損傷修復(fù)中表現(xiàn)出了不同于TGF-β1的抗纖維化特性，但是目前缺少TGF-β3用于放射性肺纖維化干預(yù)措施的依據(jù)。本研究以雌性C57BL/6小鼠為實驗對象，建立放射性肺纖維化模型，觀察TGF-β3對小鼠放射性肺纖維化的影

3、響，尋找TGF-β3在放射性肺纖維化中可能的調(diào)控機制，為臨床放射性肺纖維化的預(yù)防和治療提供新的線索。
　　材料與方法:雌性C57BL/6小鼠（6-8周，20±2g）麻醉后固定于自制的照射板上，除胸部外其余部分用10cm鉛磚防護(hù)，采用60Coγ-射線單次胸部照射，照射劑量為20Gy，照射源距3m，劑量率215cGy/min。在照后4h照射組給予腹腔注射0.5ml生理鹽水，TGF-β3組給予0.5ml人重組TGF-β3（1μg/kgb

4、w，生理鹽水稀釋），此后每周給藥一次。分別于照后1個月、3個月和6個月，觀察小鼠的大體情況，檢測外周血細(xì)胞參數(shù)，活殺后進(jìn)行常規(guī)病理檢查和Masson三色染色觀察，免疫組織化學(xué)法檢測肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetallopeptidase-9，MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor ofmetalloproteinases-1，TIMP-1)的表達(dá)，檢測肺灌洗液(BALF)中細(xì)胞分類及細(xì)胞

5、因子含量，流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血Treg、肺內(nèi)循環(huán)纖維細(xì)胞、Th17與Treg等。
　　采用分離培養(yǎng)人外周血白膜的單個核細(xì)胞(PBMC)及Treg細(xì)胞建立體外培養(yǎng)體系，分別以不同劑量、不同比例的TGF-β1和TGF-β3混合刺激PBMC，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測PBMC向循環(huán)纖維細(xì)胞的分化情況。并將Treg細(xì)胞與PBMC共培養(yǎng)，檢測Treg細(xì)胞對PBMC向循環(huán)纖維細(xì)胞的分化的影響。
　　實驗結(jié)果:
　　1、60Coγ-射線

6、單次胸部20Gy照射后小鼠體重增加變緩，肺重略微增加，因而肺臟系數(shù)也略微增加。
　　2、小鼠照射后外周血白細(xì)胞數(shù)有一定波動，TGF-β3組血紅細(xì)胞顯著降低(P＜0.05)，血小板有增高趨勢。
　　3、BALF中有核細(xì)胞計數(shù)和分類結(jié)果顯示照射組與TGF-β3組BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)有增高的趨勢，但統(tǒng)計學(xué)無顯著差異。液體懸浮芯片細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示照射后小鼠BALF中趨化因子有先增高后降低的趨勢。而TGF-β3組促炎因

7、子IL-12分泌增多、抑炎因子IL-4分泌減少。照射組的促炎因子IL-17隨著照后時間延長有增加的趨勢，其中在照后6個月顯著高于對照組(P＜0.05)，而TGF-β3組的IL-17變化情況跟照射組正好相反，在照后1個月時顯著增加（P＜0.05），隨后降低并恢復(fù)至正常水平。生長因子中，照射組和TGF-β3組的FGF-basic在照后出現(xiàn)了先增高再降低最后恢復(fù)的波動情況。照射組的VEGF在照后有增高的趨勢，其中在照后1個月和照后6個月時與對

8、照組相比顯著增加(P＜0.05)。
　　4、照射能夠引起照射組小鼠出現(xiàn)肺泡壁增厚、肺泡間隔明顯增寬、成纖維細(xì)胞大量增生、肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞、膠原纖維大量沉積的典型纖維化病理改變。給予TGF-β3組小鼠病理變化比照射組出現(xiàn)的晚且程度較輕，同時膠原沉積減少，但仍然可見炎性淋巴細(xì)胞浸潤，蛋白樣液體滲出，局部肺泡萎陷，部分肺泡腔融合擴大，局部肺泡間隔增寬，以及部分綠染的膠原纖維。
　　5、免疫組化結(jié)果顯示照射后小鼠肺內(nèi)MMP-9、TI

9、MP-1表達(dá)與對照組相比均明顯增加，其中MMP-9隨照后時間的延長增加的更為顯著，TGF-β3組MMP-9表達(dá)顯著高于照射組(P＜0.05)。TIMP-1隨照后時間延長變化趨勢不明顯。
　　6、照射組小鼠從照后1個月起肺內(nèi)循環(huán)纖維細(xì)胞明顯增加（P＜0.05），隨照后時間的延長，出現(xiàn)降低，但仍高于對照組(P＜0.05)。照后1個月時，TGF-β3組循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)明顯低于照射組(P＜0.05)，與對照組相比仍有增高（P＜0.05）;3

10、m時與照射組水平接近;而6個月時低于照射組，恢復(fù)至對照組水平。
　　7、照射組和TGF-β3組外周血Treg細(xì)胞比例隨著照后時間的延長有降低趨勢，但與對照組相比無明顯差異。照射組肺內(nèi)Th17細(xì)胞比例均顯著高于對照組（P＜0.05），而且隨著照后時間延長而增高。而TGF-β3組變化規(guī)律和照射組相反，Th17細(xì)胞比例隨著照后時間延長而降低，在照后1個月達(dá)到高峰，且顯著高于照射組（P＜0.05），到了照后6個月時，雖然仍然顯著高于對照組

11、(P＜0.05)，但已經(jīng)顯著低于照射組(P＜0.05)。照射組肺內(nèi)Treg細(xì)胞比例均顯著高于對照組（P＜0.05），而且隨著照后時間延長而降低。而TGF-β3組Treg細(xì)胞比例隨著照后時間延長而波動，其中在照后3個月達(dá)到高峰，且顯著高于照射組（P＜0.05）。照射組Th17/Treg細(xì)胞比例隨著照后時間延長而增高，其中在照后6個月時顯著高于對照組（P＜0.05）。而TGF-β3組Th17/Treg細(xì)胞比例隨著照后時間延長而降低，在照后1

12、個月達(dá)到高峰，顯著高于照射組與對照組(P＜0.05)，到了照后6個月時，與對照組相比已經(jīng)無明顯差異并且顯著低于照射組（P＜0.05）。
　　8、體外實驗結(jié)果表明，TGF-β1和TGF-β3都能促進(jìn)體外培養(yǎng)的人PBMC向循環(huán)纖維細(xì)胞分化，但TGF-β3的促分化能力顯著弱于TGF-β1。另外TGF-β3能夠部分拮抗TGF-β1誘導(dǎo)PBMC向循環(huán)纖維細(xì)胞分化的能力。Treg在一定比例時與PBMC共培養(yǎng)可以促進(jìn)PBMC向循環(huán)纖維細(xì)胞分化，

13、但隨著Treg與PBMC的比例上升，Treg反而表現(xiàn)出抑制PBMC向循環(huán)纖維細(xì)胞分化的能力，而且這種調(diào)控能力并不依賴于Treg和PBMC的接觸抑制。
　　結(jié)論:
　　1、TGF-β3可以減輕小鼠放射性肺纖維化的程度，延緩放射性肺纖維化的病程。
　　2、TGF-β3通過調(diào)節(jié)肺內(nèi)MMP-9/TIMP-1比例、Th1/Th2型細(xì)胞因子、Th17/Treg細(xì)胞平衡、減少肺內(nèi)循環(huán)纖維細(xì)胞的募集與分化減輕小鼠放射性肺纖維化。