鏈狀亞歷山大藻環(huán)境條件響應基因的篩選及我國北黃海海域微型藻的分離鑒定.pdf

1、隨著全球工業(yè)化的發(fā)展，環(huán)境狀況日益惡化，赤潮頻繁發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)水體富營養(yǎng)化及微量元素是赤潮生物爆發(fā)性生長的因素。但目前為止尚未有報道把赤潮爆發(fā)的環(huán)境條件和分子生物學研究聯(lián)系起來，從分子角度揭示赤潮爆發(fā)的內在機制。普遍的研究認為，高濃度的磷、錳對鏈狀亞歷山大藻的生長具有促進作用，本研究把利于赤潮生物生長的環(huán)境條件和分子技術結合，構建與高磷濃度誘導相關的鏈狀亞歷山大藻基因表達抑制性消減文庫，并在錳條件誘導生長細胞中進行基因表達的驗證，使得到

2、的基因片段既與鏈狀亞歷山大藻高磷濃度生長相關，又與其高錳濃度生長相關，從而減少藻體對單一因子的響應而產生的假陽性，為獲得赤潮爆發(fā)性生長相關基因及其應用奠定基礎，為赤潮預報和防治提供資料。 經對不同磷濃度條件下鏈狀亞歷山大藻消減文庫的383個克隆進行檢測，獲得348個陽性克隆，陽性率達90.9％，后采用兩輪斑點雜交，即將獲得的348個克隆的PCR產物純化后先與低磷和高磷的cDNA探針進行雜交，選取雜交信號差異在1.4倍以上的克隆

3、，再分別與無錳及高錳的cDNA探針雜交，選取雜交信號差異在1.4倍以上陽性克隆12個測序，獲得了6個可分析的基因片段，分別與生長、翻譯起始和能量傳遞有關，其中2個為編碼未知功能蛋白基因片段，1個與轉化蛋白功能有相似性，但相似性較低。對已知功能的3個基因片段設計引物，采用熒光定量PCR分析基因表達差異，其中1個編碼eIF-4A基因及1個未知功能的SSH298，與文庫篩選及斑點雜交中得到的信息一致。初步認為在赤潮爆發(fā)性生長中eIF-4A基因

4、的表達量增多，通過影響和加強翻譯的起始，起始或加速了細胞的快速生長分裂。 在海洋初級生產中，微型浮游生物是非常重要的貢獻者，因為在水域中微型浮游生物的分布密度極大，是浮游植物的主要組成部分，可維持相當高程度的生產力。但目前針對微型浮游生物的分類研究較少，涉及的未認定物種較多，沒有統(tǒng)一的分類學目錄，鑒定較為困難，從而使微型藻的研究進展緩慢。 為了豐富微型藻的記錄種類和科研的需要，我們在進行海洋微型浮游生物調查的同時，將

5、固定化樣品經一系列處理后，借助掃描電子顯微鏡(SEM)對原甲藻屬一浮游植物進行了觀察描述，藻細胞呈圓形至橢圓形，長約15-23μm，寬為8-15μm，細胞表面有數(shù)量豐富的顆粒狀突起，每平方微米有7-10個顆粒狀突起。藻體的中央有1條片間帶，片間帶寬度大約為0.6-1.5μm之間，有漸狹趨向，最后呈中縫狀。在片間帶之間同樣存在顆粒狀突起。細胞殼面觀在片間帶上方殼面邊緣有刺絲胞孔，刺絲胞孔周圍分布2-3個輔助孔。經比較發(fā)現(xiàn)該藻細胞表面結構和

6、原甲藻屬中的微小原甲藻，東海原甲藻雖有相似之處，但在某些基本特征上存在明顯的差異，由于甲藻分類學尤其是微型藻分類本身存在的局限性，且在采集水樣后，不能立即進行大量的生物培養(yǎng)，所以無法進行進一步的分子生物學鑒定命名，我們只將其劃分為原甲藻屬的一未定種Prorocentrum sp. 另外，將未固定的樣品經一系列過濾處理后，培養(yǎng)于F/2培養(yǎng)基中，經有限稀釋法分離純化到一株微型硅藻，經掃描電子顯微鏡及透射顯微鏡下觀察，和Minuto

7、cellus polymorphus極為相似，但形態(tài)上仍有部分差異，后根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中相近物種的18srDNA設計引物，PCR擴增其18rDNA序列，經測序鑒定，與Minutocellus polymorphus的18rDNA部分序列相似度極高，由于18rDNA的高度保守性，其分類階元只能劃分到屬，而種間劃分則需要獲得相關的5.8SrDNA及ITS序列，但目前尚未有Minutocellus polymorphus相關區(qū)域序列的報道，