基因克隆步驟完整版

1、1總RNA提取提取(1)液氮研磨或冰上勻漿實(shí)驗(yàn)材料；先將1mlTrizol加到離心管中待用(2)將研磨好的樣品加到離心管中混勻，室溫放置5min；打開離心機(jī)預(yù)冷(3)加200L氯仿，振蕩15sec，室溫放置3min，分層；(4)4oC，12000g，離心15min；(5)取上清，加500μL異丙醇，混勻，室溫放置10min；(6)4oC，12000g，離心10min；(7)棄上清，加1mL75%乙醇，漂浮洗滌沉淀，振蕩充分；再用100%

2、乙醇清洗(8)4oC，7500g，離心5min；(9)棄上清，離心，用槍吸取多余液體，放在超凈臺里干燥后，加50μLDEPC水，－80oC保存。此操作中所用到的器皿均需經(jīng)過DEPC滅活RNA酶處理。提取的總RNA需經(jīng)RNA電泳檢測質(zhì)量，并用紫外分光光度計測定濃度。OD260值為核酸的吸收值，OD280值為蛋白的吸收值，OD260280值在1.82.0間一般說明該核酸蛋白含量在允許的范圍內(nèi)，可正常使用；此外還有OD230值為多糖和酚類的吸

3、收值，比較干凈的核酸OD260230值能達(dá)到2.2左右。RNA濃度計算公式：總RNA濃度（gmL）=A260稀釋倍數(shù)40。4基因克隆及測序基因克隆及測序4.1PCR產(chǎn)物切膠回收產(chǎn)物切膠回收將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外燈下觀察并切下預(yù)期大小的DNA片段。使用TIANGEN公司的UniversalDNAPurificationKit割膠回收試劑盒進(jìn)行純化，步驟如下：(1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入

4、500μL平衡液BL，13400g離心1min，倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(2)按100mgagarose膠加入100μL溶液PC，置于50oC中10min左右，中途混勻幾次，至膠完全融化；(3)將樣品倒入一個吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室溫下13400g離心1min，倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW（加乙醇），室溫下13400g離心1mi

5、n，倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(5)重復(fù)上一步驟；(6)將吸附柱CB2放入收集管中，室溫下13400g離心2min，盡量除去漂洗液，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干；(7)將柱子套入一新的滅菌1.5mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50L洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，13400g室溫離心2min，收集到的洗脫液即為回收的DNA純化液；(8)取5L的純化液體進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢查純度，并測量溶液中DN