分子生物學結課論文

1、基因編輯技術的研究進展基因編輯技術的研究進展摘要：基因組編輯是建立在基因靶向修飾的基礎上，對生物基因組進行改造的一項新技術。通過利用人工核酸酶ZFn、TALEN和細菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR，可在靶位點制造DNA雙鏈切口進而誘導細胞內源性修復機制，通過同源重組修復或非同源末端連接途徑實現(xiàn)基因敲除、替換和糾正。對目前3個主要的基因編輯技術的應用和發(fā)展作一綜述。關鍵詞關鍵詞：基因編輯；鋅指核酸酶；TALEN；CRISPRCas9Abstr

2、act:GenomeEditingisbuiltonthebasisofgenetargetedmodificationofthegenomeofanewbiotechnologytransfmation.ThroughtheuseofartificialnucleasesZFnTALENacquiredimmunesystemsbacterialCRISPRcanbemanufacturedatthetargetpointthenin

3、ducedDNAdoublestrincisionendogenousrepairmechanismswithinthecellconnectedwaytoachievegeneknockoutbyhomologousrecombinationnonhomologousendrepairInadditionthereplacementcrection.Applicationdevelopmentofthecurrentthreemajg

4、eneeditingtechniquesarereviewed.Keywds:GeneEditingZincfingernucleaseTALENCRISPRCas9.引言：21世紀以來，科學家一直在尋求更加精確的方法對特定的基因進行敲除或者靶向修飾。20世紀80年代，研究者們可以利用同源重組的方法來對特定的基因進行靶向修飾，但由于自然重組的過程非常罕見，所以，這種方法效率非常低，只能達到106。之后的研究發(fā)現(xiàn)，真核細胞的染色體發(fā)生雙鏈

5、斷裂時，細胞會通過DNA同源重組或者非同源末端連接機制修復雙鏈斷裂[1]，在修復過程中會出現(xiàn)高幾率的基因缺失、插入和改變。所以，利用各種方法在染色體上的特定位點進行精確切割誘發(fā)DNA損傷修復，使得對真核生物進行精確的基因操作成為可能，以此實現(xiàn)特定細胞組織的遺傳操作[7]。2011年，人工核酸酶介導的基因組編輯技術被NatureMethods雜志評選為年度最受關注的技術成果。這3種酶包括有3個主要的類型——鋅指核酸酶(zincfinger

6、nucleasesZFn)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(tranionactivatlikeeffectnucleasesTALEN)，以及歸巢核酸內切酶(meganuclease)[5]。本文主要通過這三種物質來介紹基因編輯技術的進展。1基因組定點編輯技術的初現(xiàn)——鋅指核酸酶(zincfingernucleases)1.1鋅指核酸酶的結構及作用原理鋅指核酸酶的結構及作用原理鋅指(zincfingerZF)是一種常見的DNA結合蛋白結構

7、基元，每個鋅指可直接特異識別DNA雙螺旋中3個連續(xù)的核苷酸。人工串聯(lián)3~6個識別不同靶位點序列的重組鋅指結構，能夠與靶序列特異性結合[1]。將多個鋅指串聯(lián)形成的ZFP結構域與IIs型限制性內切酶FokI的切割結構域相連接，就可構建成鋅指核酸酶(ZFn)，實現(xiàn)對靶序列的切割。增加串連鋅指的數(shù)目可識別更長的靶序列同時也就增加了DNA靶向修飾的特異性[8]。由于FokI需要二聚化來切割DNA，所以，設計好的兩個互補的ZFn分子同時與靶位點結合

8、，當兩個互補的ZFn分子間相距恰當?shù)木嚯x時(6~8bp)，F(xiàn)okI結構域將二聚化并切割DNA，從而可特異性地在基因組特定位點切斷DNA形成“雙鏈斷裂缺口”。雙鏈斷裂可以啟動細胞內的DNA損傷修復機制，一方面細胞通過錯配率很高的“非同源重組末端連接”機制修復雙鏈斷裂，從而在ZFn靶位點40%。目前，TALEN也像ZFn一樣，被應用到了不同種的細胞及生物的基因組編輯中。至今為止，研究者們已經(jīng)應用TALENs對果蠅、蛔蟲、斑馬魚、青蛙、大鼠和

9、豬等模式生物[7]進行了基因組定點編輯[11]。而使用TALEN技術對牛、蟋蟀和家蠶等非模式生物進行內源基因的定點修飾也有報道。在目前的研究中，大多數(shù)研究者都使用一對TALENs對目標基因進行敲除，也有一些報道同時使用了兩對TALEN對同一條染色體上的兩個位點進行敲除，使基因組缺失更大的片段。同樣的，也已經(jīng)有研究者利用TALEN和同源片段的引入實現(xiàn)了在斑馬魚和人的基因組中進行定點插入[10]。在各種遺傳疾病的治療方面，TALEN技術的高

10、精確性使得對這些錯誤基因的修飾比ZFn更具潛力。Mussolino等利用TALEN和ZFn兩個技術對人胚肺293細胞的CCR5及CCR2位點中19bp的靶序列成功進行了定點敲除，且TALEN的脫靶切割幾率比ZFn要低得多。Sun等利用設計的一對TALEN和同源性序列成功地對缺陷型β珠蛋白基因進行了更改，使其恢復到正常序列。2.3TALEN的優(yōu)勢和局限的優(yōu)勢和局限相比ZFn技術，TALEN使用了TALE分子代替ZF作為人工核酸酶的識別結構

11、域，極好地解決了ZF對于DNA序列識別特異性低的問題。TALE蛋白與DNA堿基是一一對應的，并且對堿基的識別只由2個氨基酸殘基決定，這相對于ZFn的設計要簡單得多。但是在構建過程中，TALE分子的模塊組裝和篩選過程比較繁雜，需要大量的測序工作，對于普通實驗室的可操作性較低，而商業(yè)化公司構建也需要花費上千美元，使用成本較高；并且，TALEN的蛋白質相對分子質量要比ZFn大得多，過大的蛋白質分子往往會增加分子操作的難度，去除TALEN分子的

12、不必要結構或者縮短識別序列的長度能一定程度地減輕影響，但是卻有可能造成識別特異性降低而導致脫靶切割，引起細胞毒性。3基因組編輯技術的新方向——CRISPRCas93.1CRISPRCas9系統(tǒng)的結構及作用原理系統(tǒng)的結構及作用原理TALEN對于靶序列識別的精確性使得該技術在近3年來得以飛速發(fā)展，但是其構建復雜，并且較大的相對分子質量在某些情況下使用困難也制約了其應用前景。自2002年以來，CRISPR一直以其奇特的結構與特殊的功能吸引著各

13、國科學家們的共同關注。它的結構非常穩(wěn)定，長度約25~50bp的重復序列(repeats)被間區(qū)序列(spacers)間隔。2005年，Cas系統(tǒng)(CRISPRassociatedsequencessystemCASs)被發(fā)現(xiàn)在原核生物中表現(xiàn)出某種獲得性免疫功能[2]，能使宿主獲得抵抗噬菌體、質粒等外來DNA入侵的免疫能力。CRISPRCas系統(tǒng)的作用機制大體可分為3個不同階段：在噬菌體侵入的起始階段，Cas蛋白復合物靶向裂解噬菌體基因組

14、中短的原型間隔序列，這些原型間隔序列整合到宿主基因組中CRISPR位點的5′端；然后這些短的摻入的間隔序列被轉錄成crRNAs；當宿主再被噬菌體感染時，crRNAs作為模板通過Cas復合物靶向降解噬菌體DNA。CRISPR系統(tǒng)大致分為3類，其中I型及III型CRISPR系統(tǒng)由復雜的Cas復合物介導DNA或RNA的降解，而在產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)中發(fā)現(xiàn)的II型CRISPR系統(tǒng)組分較為簡單，只需要Cas9和

15、兩個非編碼RNA，3個組分即可介導外源DNA片段的靶向降解，所以目前針對CRISPRCas9研究較多。在CRISPRCas9系統(tǒng)中，外源的DNA進入細胞內，細菌的RNaseIII催化crRNA的成熟，成熟的crRNA通過堿基配對與tracrRNA結合，形成雙鏈RNA構[3]。這一crRNA:tracrRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶標的特定位點剪切雙鏈DNA，在與crRNA引導序列互補的位點，Cas9蛋白的HNH核

16、酸酶結構域剪切互補鏈，而Cas9RuvCI結構域剪切非互補鏈。3.2CRISPRCas9系統(tǒng)在基因組編輯中的應用系統(tǒng)在基因組編輯中的應用利用CRISPRCas9系統(tǒng)對DNA分子的靶向切割特性，使其可以被用于定向的基因修飾。2012年，來自加州大學伯克利分校的DouDNA研究小組首先利用人工設計的crRNAs序列，使用產(chǎn)膿鏈球菌的CRISPRCas9系統(tǒng)對體外的DNA靶序列進行了精確切割，并且把crRNA:tracrRNA二元復合體改造為