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文檔簡介
1、赤潮藻類的鑒定是治理赤潮的關(guān)鍵步驟。目前,利用分子生物學(xué)手段檢測微藻的方法日漸成熟,許多學(xué)者通過對核糖體rDNA序列分析成功進(jìn)行了分子鑒定。據(jù)報(bào)道米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)和環(huán)狀異帽藻(Heterocapsa Circularisquama)屬于2種外來入侵赤潮藻類,該兩種藻入侵可能與船舶壓艙水傳播有關(guān)。本研究通過對兩種外來入侵赤潮藻的培養(yǎng),結(jié)合傳統(tǒng)鑒定方法和PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法等方法進(jìn)行定性分析,
2、初步構(gòu)建了這兩種外來入侵赤潮藻的分子鑒定方法,為控制外來入侵赤潮物種,赤潮的快速預(yù)報(bào)和治理提供技術(shù)支撐。 本文主要包括以下方面: 一、概述赤潮的產(chǎn)生、危害、分類、成因,我國赤潮狀況及赤潮生物鑒定研究歷史和國內(nèi)外研究現(xiàn)狀。在利用分子生物學(xué)鑒定方面,概括了PCR、LAMP等鑒定技術(shù)的研究概況。 二、對赤潮多發(fā)藻米氏凱倫藻核糖體18S rDNA及其轉(zhuǎn)錄間隔(ITS)區(qū)序列PCR擴(kuò)增后測序,獲得18S rDNA和I
3、TS基因序列。結(jié)合12種甲藻和1種硅藻作序列比較分析,以尋找適宜設(shè)計(jì)特異性引物探針區(qū)域.并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,研究各藻種間親緣關(guān)系。結(jié)果表明以18S rDNA與ITS序列構(gòu)建的進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相一致,18S rDNA序列相對保守,適合進(jìn)行屬以上關(guān)系的系統(tǒng)進(jìn)化分析,而ITS序列變異較大,適合種屬間鑒別分析,且ITS1和ITS2是變異很大的區(qū)域,適合種間的分子特異性鑒定。 三、利用核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)區(qū)分別設(shè)計(jì)出針對兩種外
4、來入侵赤潮藻米氏凱倫藻和環(huán)狀異帽藻的特異性PCR擴(kuò)增引物,通過篩選,選擇最佳引物Ki1F3/Ki1B3、YiF3a/YiB3a。以鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium catenella)、立瑪原甲藻(Prorocentrum lima)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muellerii)、赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)作為陰性對照,做進(jìn)一步PCR驗(yàn)證,為赤潮的預(yù)測預(yù)報(bào)提供分子鑒定基礎(chǔ)。 四、利
5、用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)成功檢測了外來入侵赤潮藻米氏凱倫藻基因,并對其反應(yīng)程序和反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化,建立起一種簡單快速的微藻檢測技術(shù)。利用本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化體系對米氏凱倫藻進(jìn)行了LAMP擴(kuò)增,得到了理想的擴(kuò)增產(chǎn)物,同時(shí)與其他8種藻類做陰性對照實(shí)驗(yàn),只有米氏凱倫藻為特異性擴(kuò)增,其他藻類均呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。另外,對擴(kuò)增終產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行酶切分析,并與以F3和B3為引物的PCR擴(kuò)增的片段相比較,均與預(yù)期結(jié)果相吻合。采用2種方法進(jìn)行肉眼檢測陽性反應(yīng)結(jié)
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