米氏凱倫藻與環(huán)狀異帽藻的分子鑒定研究.pdf

1、赤潮藻類的鑒定是治理赤潮的關(guān)鍵步驟。目前，利用分子生物學手段檢測微藻的方法日漸成熟，許多學者通過對核糖體rDNA序列分析成功進行了分子鑒定。據(jù)報道米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）和環(huán)狀異帽藻（Heterocapsa Circularisquama）屬于2種外來入侵赤潮藻類，該兩種藻入侵可能與船舶壓艙水傳播有關(guān)。本研究通過對兩種外來入侵赤潮藻的培養(yǎng)，結(jié)合傳統(tǒng)鑒定方法和PCR、環(huán)介導等溫擴增（LAMP）法等方法進行定性分析，

2、初步構(gòu)建了這兩種外來入侵赤潮藻的分子鑒定方法，為控制外來入侵赤潮物種，赤潮的快速預報和治理提供技術(shù)支撐。 本文主要包括以下方面： 一、概述赤潮的產(chǎn)生、危害、分類、成因，我國赤潮狀況及赤潮生物鑒定研究歷史和國內(nèi)外研究現(xiàn)狀。在利用分子生物學鑒定方面，概括了PCR、LAMP等鑒定技術(shù)的研究概況。 二、對赤潮多發(fā)藻米氏凱倫藻核糖體18S rDNA及其轉(zhuǎn)錄間隔（ITS）區(qū)序列PCR擴增后測序，獲得18S rDNA和I

3、TS基因序列。結(jié)合12種甲藻和1種硅藻作序列比較分析，以尋找適宜設計特異性引物探針區(qū)域．并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，研究各藻種間親緣關(guān)系。結(jié)果表明以18S rDNA與ITS序列構(gòu)建的進化樹拓撲結(jié)構(gòu)相一致，18S rDNA序列相對保守，適合進行屬以上關(guān)系的系統(tǒng)進化分析，而ITS序列變異較大，適合種屬間鑒別分析，且ITS1和ITS2是變異很大的區(qū)域，適合種間的分子特異性鑒定。 三、利用核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）區(qū)分別設計出針對兩種外

4、來入侵赤潮藻米氏凱倫藻和環(huán)狀異帽藻的特異性PCR擴增引物，通過篩選，選擇最佳引物Ki1F3/Ki1B3、YiF3a/YiB3a。以鏈狀亞歷山大藻（Alexandrium catenella）、立瑪原甲藻（Prorocentrum lima）、牟氏角毛藻（Chaetoceros muellerii）、赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）作為陰性對照，做進一步PCR驗證，為赤潮的預測預報提供分子鑒定基礎。 四、利

5、用環(huán)介導恒溫擴增（LAMP）技術(shù)成功檢測了外來入侵赤潮藻米氏凱倫藻基因，并對其反應程序和反應體系進行了優(yōu)化，建立起一種簡單快速的微藻檢測技術(shù)。利用本實驗優(yōu)化體系對米氏凱倫藻進行了LAMP擴增，得到了理想的擴增產(chǎn)物，同時與其他8種藻類做陰性對照實驗，只有米氏凱倫藻為特異性擴增，其他藻類均呈現(xiàn)陰性反應。另外，對擴增終產(chǎn)物進一步進行酶切分析，并與以F3和B3為引物的PCR擴增的片段相比較，均與預期結(jié)果相吻合。采用2種方法進行肉眼檢測陽性反應結(jié)