三種重金屬對(duì)斑馬魚發(fā)育聯(lián)合毒性及迷迭香酸干預(yù)作用研究.pdf

1、重金屬可通過食物鏈富集，造成嚴(yán)重的生態(tài)毒理效應(yīng)，并損害人體健康，本研究以模式生物斑馬魚為研究對(duì)象，建立了斑馬魚Cd2+、Pb2+、Cu2+三種重金屬聯(lián)合染毒模型，并考察天然抗氧化劑迷迭香酸（Rosmarinic acid，RA）對(duì)氯化鎘（CdCl2）、硝酸鉛（Pb(NO3)2）、硫酸銅（CuSO4）暴露所致斑馬魚發(fā)育毒性的干預(yù)作用，初步探討其作用機(jī)制。
　　本研究通過致死毒性和致畸性實(shí)驗(yàn)研究CdCl2、Pb（NO3）2、CuSO4

2、三種重金屬對(duì)囊胚期斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性及RA對(duì)重金屬發(fā)育毒性的干預(yù)作用。收集受精1h后（1hpf）的斑馬魚胚胎暴露于含不同濃度迷迭香酸及CdCl2、Pb（NO3）2、CuSO4溶液中，觀察96hpf胚胎死亡率和孵化率；采用吖啶橙（AO）染色觀察胚胎細(xì)胞凋亡情況；用DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總活性氧水平，MitoSOX檢測(cè)線粒體源ROS，JC-1檢測(cè)線粒體膜電勢(shì)；采用Long PCR方法檢測(cè)胚胎細(xì)胞線粒體DNA（mtDNA）損傷；用SYBR

3、熒光實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）方法檢測(cè)胚胎mRNA的表達(dá)，并用比較CT值法進(jìn)行相對(duì)定量。
　　主要結(jié)果及結(jié)論：
　　（1）10.0-40.0mg/L CdCl2誘導(dǎo)斑馬魚胚胎死亡及幼魚畸形，使胚胎孵化率降低，100-450mg/L Pb(NO3)2導(dǎo)致斑馬魚胚胎死亡，胚胎未孵化率較低，1-5mg/L CuSO4對(duì)斑馬魚胚胎的孵化率、死亡率影響較大。60μmol/L RA與Cd2+-Pb2+-C

4、u2+重金屬聯(lián)合處理胚胎死亡率和未孵化率會(huì)降低（P<0.01）。Cd2+、Pb2+、Cu2+三種重金屬對(duì)斑馬魚胚胎半數(shù)致死量分別為26.110mg/L、271.984mg/L、3.755mg/L，Cd2+-Pb2+兩者聯(lián)合對(duì)斑馬魚胚胎半數(shù)致死量分別為16.534mg/L、89.997mg/L，其毒性上升，表現(xiàn)為協(xié)同作用；Cd2+-Cu2+兩者聯(lián)合對(duì)斑馬魚胚胎半數(shù)致死量為13.808mg/L、1.065mg/L，聯(lián)合毒性為協(xié)同作用；Pb2

5、+-Cu2+兩者聯(lián)合對(duì)斑馬魚胚胎半數(shù)致死量濃度分別為113.805mg/L、2.735mg/L，聯(lián)合毒性為拮抗作用。Cd2+-Pb2+-Cu2+三者聯(lián)合對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性為13.470mg/L、40.410mg/L、3.551mg/L，聯(lián)合毒性為協(xié)同作用。
　?。?）Cd2+-Pb2+-Cu2+聯(lián)合組可升高胚胎細(xì)胞內(nèi)總ROS和線粒體源ROS水平，降低線粒體膜電勢(shì)（P<0.01，與空白比較）；60μmol/L RA與Cd2+-Pb

6、2+-Cu2+聯(lián)合明顯降低胚胎細(xì)胞內(nèi)總ROS和線粒體源ROS水平；升高胚胎細(xì)胞線粒體的膜電勢(shì)（P<0.01，與Cd2+-Pb2+-Cu2+聯(lián)合組比較）。Cd2+-Pb2+-Cu2+聯(lián)合處理可促進(jìn)斑馬魚胚胎細(xì)胞凋亡（P<0.01，與空白組對(duì)比），RA對(duì)其起到抑制作用（P<0.01，與Cd2+-Pb2+-Cu2+聯(lián)合組相比）。
　?。?）Long PCR結(jié)果顯示：Cd2+-Pb2+-Cu2+重金屬處理組mtDNA損傷最嚴(yán)重，RA對(duì)重金

7、屬造成的mtDNA損傷有一定保護(hù)作用，胚胎凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少。Cd2+-Pb2+-Cu2+重金屬處理組Sirt1、PGC-1α、Nrf1基因表達(dá)下調(diào)（P<0.01，與空白組對(duì)比）；RA與Cd2+-Pb2+-Cu2+聯(lián)合組中Sirt1、PGC-1α、Nrf1基因表達(dá)上調(diào)（P<0.01，與Cd2+-Pb2+-Cu2+聯(lián)合組相比），Cd2+-Pb2+-Cu2+重金屬組Bcl-2/Bax比值降低（P<0.05，與空白比較），Caspase-2基

8、因表達(dá)上調(diào)（P<0.01），RA與Cd2+-Pb2+-Cu2+共同處理組Bcl-2/Bax比值升高（P<0.05，與Cd2+-Pb2+-Cu2+聯(lián)合組相比），Caspase-2基因表達(dá)下調(diào)（P<0.01，與Cd2+-Pb2+-Cu2+聯(lián)合組相比）。
　?。?）一定濃度下，CdCl2、Pb(NO3)2、CuSO4單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚具有發(fā)育毒性，抗氧化劑RA可減弱三種重金屬所致的毒性效應(yīng)，起到保護(hù)作用。RA防御Cd2+-Pb2+-