甲基對硫磷降解菌的分離鑒定及水解酶基因克隆表達(dá).pdf

1、甲基對硫磷(methyl parathion，簡稱MP)是一種高效高毒的有機磷農(nóng)藥，其主要的中間代謝產(chǎn)物為對硝基苯酚(p-nitrophenol，簡稱PNP)，易溶于水，中等毒性。由于二者含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，殘留期長，給人類健康帶來潛在威脅。利用微生物對有機磷農(nóng)藥的降解性能消除其在環(huán)境中的殘留，具有高效率、低成本、無二次污染、降解徹底等優(yōu)點，是修復(fù)有機磷農(nóng)藥污染土壤的有效途徑之一。 本文從湖北沙隆達(dá)農(nóng)藥廠污水處理池的污泥中分離篩選到多

2、株能降解甲基對硫磷的菌株，其中菌株HS．D36具有較好的降解性能。結(jié)合生理生化及16S rDNA對其進(jìn)行了鑒定，并采用高效液相色譜法和分光光度法對其降解特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，HS-D36能以甲基對硫磷為唯一碳源和氮源生長；該菌在3h內(nèi)能降解50mg／L MP 90％，在12h內(nèi)將50mg／L PNP完全降解；在以MP為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基上可以耐受800mg／L的MP，在LB培養(yǎng)基上可耐受2,000mg／L MP。利用HS-D36

3、基因組DNA，PCR擴增出16S rDNA片斷，測序并進(jìn)行BLAST檢索比對，表明HS-D36與施氏假單胞菌屬(Pseudomonas stutzeri)的同源性為100％。結(jié)合生理生化特性，確定HS-D36為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)，命名為Pseudomonas stutzeri HS-D36。 以HS-D36基因組DNA為模板，用PCR法克隆其水解酶基因mpd。將克隆到的mpd基因進(jìn)行測序，其

4、結(jié)構(gòu)基因全長為996bp，在GenBank中注冊，序列號為EF515812。測序結(jié)果在Genebank nucleic-nucleic Blast進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與其它甲基對硫磷降解菌的mpd基因同源性高達(dá)99％，說明該菌的mpd基因可能是甲基對硫磷水解酶基因的同源基因。將HS-D36的mpd基因首先克隆至載體pMD-18，得到重組克隆載體pMD-mpd；然后亞克隆到高效表達(dá)載體pET-28，得到重組表達(dá)載體pET-mpd。將重組表達(dá)載體