紅樹林濕地微生物共代謝多環(huán)芳烴的途徑及其機(jī)理研究.pdf

1、紅樹林濕地是一個(gè)廣泛分布于熱帶亞熱帶的連接海洋生態(tài)系統(tǒng)和陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要潮間帶區(qū)域，蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源。隨著沿海城市的開發(fā)及港口駁岸海運(yùn)的發(fā)展，紅樹林濕地已成為多環(huán)芳烴(PAHs)等有機(jī)污染物的沉積地。經(jīng)過長(zhǎng)期的馴化作用，紅樹林濕地微生物具有降解有機(jī)污染物的巨大潛能，可以應(yīng)用于PAHs污染環(huán)境的生物修復(fù)。由于濕地環(huán)境微生物復(fù)雜多樣以及各種PAHs混合污染，共代謝是促進(jìn)PAHs快速降解的主要途徑，但是共代謝過程復(fù)雜，共代謝機(jī)理并不十

2、分清楚。因此，本論文的研究目的是從珠江三角洲深圳福田紅樹林濕地中分離PAHs降解菌，從PAHs降解動(dòng)態(tài)、降解途徑和代謝物動(dòng)態(tài)變化的研究角度，深入研究濕地多種微生物和多種PAHs共存時(shí)的共代謝途徑和機(jī)理，探討共代謝在實(shí)際生物修復(fù)應(yīng)用中的潛在可行性，為紅樹林濕地PAHs污染的生物修復(fù)奠定理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下： 1.在紅樹林濕地底泥中分離出新的PAHs降解菌。以芘和菲為唯一的碳源和能源從深圳福田紅樹林濕地底泥中分離出兩

3、種PAHs降解菌，分別命名為A1-PYR和PheB4，另外還分離出一種非PAHs降解菌，命名為PheB2，該菌能抵抗PAHs的脅迫，普遍存在于紅樹林濕地底泥中。通過擴(kuò)增部分16S rDNA序列比對(duì)以及細(xì)菌的形態(tài)、革蘭氏染色分析，A1-PYR、PheB4和PheB2分別鑒定為分枝桿菌(Mycobacterium sp．)、鞘氨醇假單胞菌(Sphingomonas sp．)和副球菌(Paracoccus sp．)。 2.單一菌共代

4、謝多種PAHs的途徑和機(jī)理。菌株A1-PYR具有單獨(dú)降解菲、熒蒽或芘的能力，能在7天內(nèi)降解100％的菲和86.9％的熒葸，而芘的降解率只有33％。不過，當(dāng)芘與菲或熒葸共存時(shí)，芘的降解率分別增加至100％和67％。芘的降解過程中產(chǎn)生了4種初始氧化產(chǎn)物(單羥基芘和3種二羥基芘)和3種環(huán)裂解產(chǎn)物(4-菲羧酸、4-羥基菲和二羥基菲)。研究發(fā)現(xiàn)，菲的加入促進(jìn)了所有芘代謝物的快速去除，而熒蒽的加入只加速了芘的初始氧化產(chǎn)物向環(huán)裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，造成環(huán)裂解

5、產(chǎn)物的積累。由此推論，菲通過芘代謝物的快速去除來促進(jìn)芘的完全降解，而熒蒽可能通過促進(jìn)芘的初始氧化反應(yīng)來促進(jìn)芘的降解，但是由于不能迅速去除芘的環(huán)裂解產(chǎn)物而導(dǎo)致芘的不完全降解。因此，多種PAHs的共代謝存在復(fù)雜的相互作用，會(huì)影響代謝物的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而影響PAHs的降解。 　　3.生長(zhǎng)基質(zhì)對(duì)單一菌共代謝單一或混合PAHs的影響。鞘氨醇假單胞菌PheB4能利用菲為唯一的碳源和能源，但是不能利用其他PAHs為唯一的碳源和能源。不過，在菲或者營(yíng)

6、養(yǎng)肉湯作為生長(zhǎng)基質(zhì)的前提下，菌株P(guān)heB4能通過共代謝方式降解一系列非生長(zhǎng)基質(zhì)PAH，如蒽、芴、熒蒽和芘。與菲作為生長(zhǎng)基質(zhì)相比，營(yíng)養(yǎng)肉湯作為生長(zhǎng)基質(zhì)更能促進(jìn)PheB4共代謝降解單一或混合PAHs的能力以及去除PAHs代謝物的能力，而且在共代謝混合PAHs時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)出3條新的芴單羥基化途徑，導(dǎo)致芴初始氧化途徑的多樣化。而以菲作為生長(zhǎng)基質(zhì)不會(huì)誘導(dǎo)出新的代謝途徑。因此，不同的生長(zhǎng)基質(zhì)會(huì)影響共代謝過程和降解途徑，在生物修復(fù)過程中添加營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)將有

7、利于PAHs的共代謝降解以及代謝物的去除。 雖然菲作為生長(zhǎng)基質(zhì)能支持非生長(zhǎng)基質(zhì)PAH的共代謝，但是菲的降解卻受到了不同程度的抑制。單一PAH(芘或熒蒽)的存在輕微地抑制了菲的完全降解，促進(jìn)了菲的自氧化產(chǎn)物7,8-苯并香豆素的積累，該產(chǎn)物的積累可能對(duì)微生物具有毒害作用。混合PAHs(熒蒽+芘)的存在不僅抑制菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)，還強(qiáng)烈抑制菲的降解以及菲代謝物的去除。與之相反，添加葡萄糖能同時(shí)促進(jìn)菲及其菲代謝物的降解。因此，在生物修復(fù)過

8、程中添加可利用碳源將有利于PAHs的降解以及代謝物的去除。 4.多種降解菌聯(lián)合共代謝PAHs的途徑和機(jī)理。分枝桿菌Al-PYR聯(lián)合鞘氨醇假單胞菌PheB4共代謝降解單一PAH(菲、熒蒽和芘)時(shí)，以非特異性的多樣化的單加氧和雙加氧途徑初始氧化PAH。例如，混合菌能在菲的任意位點(diǎn)上進(jìn)行單加氧化反應(yīng)，生成1-、2-、3-、4-和9-羥基菲。與單一菌相比，分枝桿菌和鞘氨醇假單胞菌聯(lián)合的混合菌降解菲和熒蒽時(shí)分別增加了8條和4條初始氧化途

9、徑，而且在熒蒽降解過程中，還新增了3條環(huán)裂解途徑，生成3種環(huán)裂解產(chǎn)物(苊醌、1，8-萘二甲酸酐和1-甲酸-8-甲內(nèi)酯)。但是，混合菌產(chǎn)生的多樣化降解途徑并沒有提高菲和熒蒽的降解率。與之相反，混合菌對(duì)于芘的降解途徑?jīng)]有太大影響，反而促進(jìn)了芘的降解。因此，混合菌導(dǎo)致的多樣化降解途徑不一定產(chǎn)生促進(jìn)作用，可能會(huì)生成對(duì)微生物有毒的代謝物而影響PAH的降解，在生物修復(fù)中應(yīng)該避免這些代謝物的積累。不過，分枝桿菌和鞘氨醇假單胞菌的聯(lián)合作用在去除高環(huán)芘上

10、具有潛在的優(yōu)勢(shì)。 5.多種降解菌聯(lián)合非降解菌共代謝單一或混合PAHs的途徑及其機(jī)理。當(dāng)分枝桿菌A1-PYR和鞘氨醇假單胞菌PheB4聯(lián)合非降解菌副球菌PheB2共代謝菲、熒蒽、芘以及三者混合物時(shí)，非降解菌的加入促進(jìn)了降解菌對(duì)熒蒽和芘的降解，卻抑制了對(duì)菲的降解。此外，非降解菌PheB2的加入還影響了菲、熒蒽和芘初始氧化途徑，例如減少了菲的雙加氧化途徑，改變了熒蒽的雙加氧化途徑以及增加了單加氧途徑，以及同時(shí)減少了芘的單加氧和雙加氧途徑。由此

11、推論，非降解菌的加入可能改變降解菌攻擊PAH的位點(diǎn)或者誘導(dǎo)降解菌產(chǎn)生其他的加氧酶系而影響PAH的初始氧化途徑。但是，非降解菌的存在沒有改變PAHs的環(huán)裂解途徑，而是促進(jìn)了某些有毒有害環(huán)裂解產(chǎn)物的積累，引發(fā)潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)問題。 另外，降解菌聯(lián)合非降解菌降解混合PAHs的過程中，PAHs之間的相互作用會(huì)影響降解途徑和代謝物的動(dòng)態(tài)變化。與菲單獨(dú)降解相比，熒蒽和芘的存在增加了2條菲的雙加氧途徑，促進(jìn)了菲單加氧化產(chǎn)物(1-羥基菲和4-羥

12、基菲)的積累，不過卻抑制了菲初始氧化產(chǎn)物的環(huán)裂解反應(yīng)。與熒蒽單獨(dú)降解相比，菲和芘的存在抑制了熒蒽初始氧化產(chǎn)物2,3-二羥基熒蒽和3-單羥基熒蒽的積累，以及某些熒蒽環(huán)裂解產(chǎn)物的積累。在芘的降解過程中，其他PAHs的存在會(huì)改變芘的雙加氧途徑，促進(jìn)芘的單加氧反應(yīng)以及初始氧化產(chǎn)物的環(huán)裂解反應(yīng)。 6.降解菌聯(lián)合非降解菌應(yīng)用于紅樹林底泥中PAHs的降解。分枝桿菌A1-PYR、鞘氨醇假單胞菌PheB4和副球菌PheB2加入到被菲、熒蒽和芘污