核受體介導(dǎo)的農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)研究.pdf

1、我國(guó)是世界上農(nóng)藥生產(chǎn)和使用量最大的國(guó)家，農(nóng)藥的生態(tài)安全和健康風(fēng)險(xiǎn)一直是備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)有研究表明農(nóng)藥可以通過(guò)多種途徑進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)，在不同的環(huán)境介質(zhì)中會(huì)形成數(shù)量眾多、結(jié)構(gòu)多樣的中間代謝產(chǎn)物。但是農(nóng)藥中間代謝產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)還是農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和管理的一個(gè)盲點(diǎn)。內(nèi)分泌干擾效應(yīng)是研究最為廣泛的污染物生態(tài)安全指標(biāo)，但關(guān)于農(nóng)藥代謝產(chǎn)物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的依舊十分缺失。本研究首先通過(guò)對(duì)斑馬魚胚胎毒性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究了農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的毒性效應(yīng)，其次

2、利用多種核受體介導(dǎo)雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)、H295R體外模型及計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)研究了由多種核受體介導(dǎo)的農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。本研究的主要工作和研究成果分為一下兩大部分：
　　(1)百菌清在斑馬魚體內(nèi)代謝產(chǎn)物的檢測(cè)及環(huán)境相關(guān)濃度下它們的胚胎毒性與內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的研究。百菌清是一種年使用量十分巨大且環(huán)境殘留較高的廣譜殺菌劑。雖然使用量非常巨大，但是關(guān)于百菌清尤其是它的代謝產(chǎn)物對(duì)水生生物的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)的研究仍然十分有限。在本實(shí)驗(yàn)

3、中，我們選取了斑馬魚作為一種水生生物的體內(nèi)模型，利用Q-TOF技術(shù)首次鑒定到了百菌清在斑馬魚體內(nèi)的代謝產(chǎn)物——4-羥基百菌清；同時(shí)我還利用PCR方法探索了百菌清由肝臟細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化機(jī)制。之后，我們利用體內(nèi)體外模型全面地評(píng)估了百菌清及4-羥基百菌清的胚胎發(fā)育毒性及潛在的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。胚胎毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明暴露96小時(shí)后，百菌清及4-羥基百菌清導(dǎo)致斑馬魚胚胎死亡的最低可見效應(yīng)濃度均為50g/L。在相同的50g/L的濃度下，

4、4-羥基百菌清對(duì)斑馬魚胚胎致死效應(yīng)大約為百菌清的2.6倍。雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果表明百菌清和4-羥基百菌清都具有雌激素激動(dòng)效應(yīng)，其REC20值分別為2.4×10-8M和3.6×10-8M。但是，在甲狀腺激素干擾效應(yīng)方面，這樣4-羥基百菌清即表現(xiàn)出了甲狀腺激素激動(dòng)效應(yīng)又表現(xiàn)出了甲狀腺激素拮抗效應(yīng)。最后，我們利用分子對(duì)接技術(shù)來(lái)預(yù)測(cè)百菌清及4-羥基百菌清與雌激素受體和甲狀腺激素受體作用強(qiáng)弱。對(duì)接的結(jié)果與雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果保持一致?？偟?/p>

5、來(lái)說(shuō)，我們的研究表明4-羥基百菌清表現(xiàn)出了比母本化合物更強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提醒我們要更加關(guān)注對(duì)殺菌劑及其代謝產(chǎn)物潛在的生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)。
　　(2)糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的4種農(nóng)藥及其21種代謝產(chǎn)物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的研究。吡丙醚、馬拉硫磷、苯霜靈和惡唑禾草靈是四種目前仍在廣泛使用的農(nóng)藥。由于其使用量大，在環(huán)境中會(huì)降解產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，因此對(duì)這些農(nóng)藥以及它們代謝產(chǎn)物的生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)評(píng)價(jià)具有重要的意義。在本實(shí)

6、驗(yàn)中，我們以CHO-K1細(xì)胞系為模型，利用MTS法對(duì)比4種農(nóng)藥及其21種代謝產(chǎn)物的毒性效應(yīng)；以雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)來(lái)評(píng)價(jià)這些化合物由糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。分子對(duì)接作為一種強(qiáng)大的工具被成功用于揭示目標(biāo)化合物與糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體的識(shí)別位點(diǎn)相互作用的具體信息。另外，我們還采用PCR和激素測(cè)定這兩個(gè)分析方法來(lái)全面地揭示目標(biāo)化合物對(duì) H295R細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)和激素分泌的影響并在原子水平模擬目標(biāo)化合物與受體之

7、間的相互作用情況。MTS實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明Pry-A,Pry-C,Pry-D,Pry-H,ML-A和BX-B均會(huì)對(duì)CHO-K1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，且ML-A的毒性最強(qiáng)，在10-8M濃度下還能顯著影響細(xì)胞活性。雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果顯示，在檢測(cè)的25種化合物中，僅Pry-F,Pry-G,ML,ML-A表現(xiàn)出了糖皮質(zhì)激素拮抗效應(yīng)。這四種化合物GR拮抗效應(yīng)的強(qiáng)弱順序?yàn)镸L-A>Pry-F>Pry-G>ML，其RIC20值分別為10-10M,3.1