LOC66273變異剪接體2對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂變化和增殖凋亡的影響.pdf

1、第一部分 LI-2基因生物信息學(xué)分析及細(xì)胞定位
　　 [目的]初步了解LI-2基因及蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和亞細(xì)胞定位，研究LI-2基因及蛋自在小鼠各組織分布情況，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。
　　 [方法]運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析LI-2基因及蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，在熒光顯微鏡下觀察其亞細(xì)胞定位。采用半定量RT-PCR檢測(cè)小鼠各組織LI-2基因mRNA水平，Western-blot免疫印跡法檢測(cè)小鼠各組織LI-2蛋白表達(dá)水平。CREB熒光

2、素酶反式報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)的高通量篩選技術(shù)篩查與CREB相互作用的調(diào)控基因。
　　 [結(jié)果](1)小鼠LI-2基因位于染色體7E2上，可譯框架為789bp，編碼122個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為13.2kDa，等電點(diǎn)為7.77；系統(tǒng)發(fā)育分析表明，LI-2基因在多種物種體內(nèi)高度保守，但與任何已知基因和蛋白質(zhì)沒(méi)有明顯同源性。保守域分析表明，LI-2中有一個(gè)預(yù)測(cè)的Mth938結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基5-120)；(2)LI-2基因在脂肪、骨骼肌、小腸、

3、肺及腎臟組織均有表達(dá)，但在脂肪和骨骼肌組織表達(dá)較高；LI-2的亞細(xì)胞定位提示，GFP-L12融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中彌漫分布，并在核周?chē)幸恍└叨燃悬c(diǎn)；(3)CREB熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果提示過(guò)表達(dá)LI-2增加了CREB的活性，其活性是空白對(duì)照組的2.5倍。
　　 [結(jié)論]LI-2基因在多種物種體內(nèi)高度保守，提示了它具有重要的功能。LI-2在白色脂肪組織高表達(dá)，同時(shí)基于定量的CREB熒光素酶反式報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)的高通量功能性篩選平

4、臺(tái)顯示了與CREB轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的基因中包括LI-2基因。這些信息都提示了LI-2基因可能與成脂分化有關(guān)。
　　 第二部分 LI-2在MDI誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞成脂分化過(guò)程中的表達(dá)變化
　　 [目的]研究MDI三聯(lián)誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化過(guò)程中LI-2變化情況。
　　 [方法]本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)油紅染色、Western-Bloting印跡、半定量RT-PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察研究MDI三聯(lián)誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)

5、胞成脂0、2、4、8天細(xì)胞形態(tài)、脂滴沉積和LI-2基因mRNA及蛋白水平變化情況。
　　 [結(jié)果](1)MDI誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞2d后，細(xì)胞逐漸變圓變亮，梭形前脂肪細(xì)胞逐漸變?yōu)闄E圓形，胞漿內(nèi)可見(jiàn)油紅0染成亮紅色的少量脂滴，誘導(dǎo)分化6d，胞核四周出現(xiàn)較大脂滴；誘導(dǎo)分化后8d，可見(jiàn)90％以上細(xì)胞具有成熟脂肪細(xì)胞表型。(2)半定量RT-PCR結(jié)果顯示MDI三聯(lián)誘導(dǎo)4d后，3T3-L1前脂肪細(xì)胞的LI-2 mRNA水平顯著升高(

6、P<0.05)，并在分化過(guò)程中持續(xù)增長(zhǎng)；Western blot結(jié)果顯示3T3-L1前脂肪細(xì)胞內(nèi)的IL-2蛋白水平隨著分化逐漸增多，誘導(dǎo)第4天變化明顯，有顯著差異(P<0.05)。
　　 [結(jié)論]用經(jīng)典的雞尾酒MDI三聯(lián)誘導(dǎo)可以成功的建立3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。隨著3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化，我們發(fā)現(xiàn)LI-2基因的mRNA和蛋白水平均較分化早期明顯升高，這進(jìn)一步證實(shí)了LI-2與細(xì)胞成脂分化相關(guān)。<

7、br>　　 第三部分過(guò)表達(dá)LI-2對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖和分化的影響
　　 [目的]在細(xì)胞過(guò)表達(dá)LI-2的情況下，研究LI-2對(duì)3T3-L1細(xì)胞成脂分化及細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　 [方法](1)用pcDNA3.1-LI2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，用倒置顯微鏡分別觀察轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA.3.1-LI2，轉(zhuǎn)染pcDNA.3.1空白載體以及MDI誘導(dǎo)的未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的三組3T3-L1前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)變化，并用油

8、紅染色觀察細(xì)胞脂滴沉積情況；(2)細(xì)胞增殖活力檢測(cè)(MTT法)檢測(cè)上述三組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)8天增殖情況：(3)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析LI-2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；(4)用流式細(xì)胞儀對(duì)上述三組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)；(5)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot免疫印跡法檢測(cè)過(guò)表達(dá)LI-2對(duì)3T3-L1細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 [結(jié)果](1)過(guò)表達(dá)LI-2的3T3-L1前脂肪細(xì)胞在沒(méi)有MDI三聯(lián)誘導(dǎo)下

9、，可見(jiàn)細(xì)胞逐漸變圓變亮，梭形成纖維細(xì)胞逐漸變?yōu)闄E圓形，與MDI誘導(dǎo)的3T3-L1前脂肪細(xì)胞變化類(lèi)似，均發(fā)生了脂肪分化，僅轉(zhuǎn)染pcDNA.3.1空白載體的3T3-L1前脂肪細(xì)胞形態(tài)未有明顯變化。用油紅O細(xì)胞染色可見(jiàn)，三組細(xì)胞培養(yǎng)8天后，pcDNA.3.1-LI2轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細(xì)胞和MDI誘導(dǎo)的3T3-L1前脂肪細(xì)胞在低倍鏡和高倍鏡下觀察均可見(jiàn)大片亮紅的脂滴，但pcDNA.3.1空白載體轉(zhuǎn)染的3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)8天后僅見(jiàn)極少

10、數(shù)脂滴；(2)用MTT法檢測(cè)空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染pcDNA.3.1-LI2質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染peDNA.3.1空白載體組細(xì)胞存活率，結(jié)果提示轉(zhuǎn)染pcDNA.3.1-LI2質(zhì)粒組的細(xì)胞存活率相對(duì)于其他兩組在轉(zhuǎn)染后4、6、8天時(shí)間點(diǎn)均明顯下降(P<0.05)；(3)流式細(xì)胞儀在分析細(xì)胞周期分布提示轉(zhuǎn)染pcDNA.3.1空白載體的細(xì)胞，在用血清處理24小時(shí)或36小時(shí)后，S時(shí)期和G2/M時(shí)期的細(xì)胞數(shù)量大大增長(zhǎng)。相反地，在血清處理24小時(shí)或36小時(shí)后，處于

11、S時(shí)期和G2/M時(shí)期的LI2過(guò)表達(dá)的3T3-L1細(xì)胞的比例幾乎沒(méi)有變化(P<0.05)；(4)流式細(xì)胞儀測(cè)轉(zhuǎn)染2天和4天三組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果提示三組細(xì)胞4天細(xì)胞凋亡率均較2天增多，但各組間無(wú)明顯差異；(5)成脂分化的兩個(gè)關(guān)鍵基因PPARγ和C/EBPα的mRNA水平在pcDNA3.1-LI2轉(zhuǎn)染的3T3-L1前脂肪細(xì)胞中高于空白載體對(duì)照組，有顯著差異(P<0.05)，基因水平也隨著培養(yǎng)天數(shù)逐漸升高；Western blot檢測(cè)3T3-L

12、1前脂肪細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LI-2或pcDNA3.1空白載體后4天和8天的PPARγ、C/EBPα、PREF-1、GADD153、α FABP和FAS的蛋白水平，結(jié)果提示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后4天和8天，過(guò)表達(dá)LI-2細(xì)胞的促成脂基因PPARγ、C/EBPα和助于脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、合成的α-FABP、FAS蛋白表達(dá)水平明顯高于空白載體對(duì)照組，而其抑制前脂肪細(xì)胞分化的Pref-1和GADD153蛋白表達(dá)水平明顯低于空白載體對(duì)照組。
　　

13、 [結(jié)論]LI-2在促進(jìn)促成脂調(diào)節(jié)因子的表達(dá)的同時(shí)也會(huì)抑制成脂負(fù)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，有利于成脂分化的進(jìn)行。另外LI-2可以抑制前脂肪細(xì)胞增殖，有促進(jìn)前細(xì)胞進(jìn)入成脂分化的作用，但在本部分實(shí)驗(yàn)未觀察到LI-2對(duì)于細(xì)胞凋亡的影響，我們將進(jìn)一步研究沉默LI-2對(duì)于細(xì)胞凋亡的影響。
　　 第四部分沉默LI-2對(duì)3T3-L1細(xì)胞凋亡和分化的影響
　　 [目的]通過(guò)沉默LI-2基因來(lái)進(jìn)一步探索LI-2與3T3-L1前脂肪細(xì)胞凋亡和分化的關(guān)

14、系及具體機(jī)制，從正反兩個(gè)方面來(lái)闡明這一論題。
　　 [方法](1)用siRNA干擾片段轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，用倒置顯微鏡分別觀察轉(zhuǎn)染siRNA干擾片段轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照non-siRNA質(zhì)粒組的細(xì)胞形態(tài)變化，并用油紅染色觀察細(xì)胞脂滴沉積情況；(2)用Hoechst33342試劑細(xì)胞染色后在熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，并用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡；(3)Ac-DEVD-AMC分析各組細(xì)胞在不同時(shí)間 easpase-3的活

15、性和用Western blot免疫印跡法檢測(cè)caspase-3蛋白表達(dá)水平；(4)CREB雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)分析沉默LI-2對(duì)CREB活性的影響，同時(shí)采用Western blot免疫印跡法檢測(cè)CREB和p-CREB的蛋白表達(dá)水平；(5)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot免疫印跡法檢測(cè)沉默LI-2對(duì)3T3-L1細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 [結(jié)果](1)沉默LI-2的兩組3T3-L1

16、前脂肪細(xì)胞在MDI三聯(lián)誘導(dǎo)下，細(xì)胞形態(tài)未有明顯變化，而MDI誘導(dǎo)的陰性對(duì)照組的3T3-L1前脂肪細(xì)胞逐漸變圓變亮，梭形成纖維細(xì)胞逐漸變?yōu)闄E圓形，發(fā)生了脂肪分化。用油紅O細(xì)胞染色可見(jiàn)，三組細(xì)胞培養(yǎng)8天后，siLI-2-1、siLI-2-2轉(zhuǎn)染的3T3-L1前脂肪細(xì)胞僅見(jiàn)極少數(shù)脂滴，MDI誘導(dǎo)的陰性對(duì)照組細(xì)胞在低倍鏡和高倍鏡下觀察均可見(jiàn)大片亮紅的脂滴；(2)3T3-L1前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染siLI-2-1、siLI-2-2或non-siRNA后2

17、天，開(kāi)始MDI三聯(lián)誘導(dǎo)4天后，熒光顯微鏡可觀察到轉(zhuǎn)染siLI-2-1、siLI-2-2細(xì)胞胞核皺縮，呈碎片狀，邊緣化，且有凋亡小體形成，而轉(zhuǎn)染non-siRNA的細(xì)胞胞核形態(tài)完整；流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染2天和4天三組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果提示，沉默LI-2的兩組細(xì)胞在MDI三聯(lián)誘導(dǎo)下，凋亡率相對(duì)于陰性對(duì)照組明顯升高；(3)上述三組細(xì)胞在MDI三聯(lián)誘導(dǎo)4天后，根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，測(cè)定caspase-3的活性結(jié)果提示，沉默LI-2的兩組細(xì)

18、胞在MDI三聯(lián)誘導(dǎo)下，caspase-3的活性相對(duì)于陰性對(duì)照組明顯升高，同時(shí)Western blot免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示caspase的蛋白表達(dá)水平也明顯高于陰性對(duì)照組；(4)CREB熒光素酶反式報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后，用MDI三聯(lián)誘導(dǎo)三組細(xì)胞2天和4天發(fā)現(xiàn)，沉默LI-2組的相對(duì)熒光素酶活性要明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)；western bloting檢測(cè)各組細(xì)胞的CREB和pCREB蛋白表達(dá)水平的結(jié)果提示，LI-2基

19、因沉默組的細(xì)胞pCREB蛋白表達(dá)水平要明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，但三組細(xì)胞的CREB蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異；(5)沉默LI-2基因抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞細(xì)胞PPARγ和C/EBPα基因mRNA和蛋白表達(dá)水平，同時(shí)也抑制了助于脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、合成的α FABP、FAS蛋白表達(dá)，但成脂負(fù)調(diào)控因子Pref-1和GADD153蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對(duì)照組。
　　 [結(jié)論]LI-2一方面通過(guò)調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞成脂分