飛秒激光雙光子熒光顯微成像技術(shù)研究.pdf

1、雙光子熒光顯微成像技術(shù)是生物成像領(lǐng)域最重要的發(fā)明之一,利用該技術(shù)可以對生物樣品進(jìn)行非侵入性研究,在三維空間內(nèi)獲得亞微米的成像分辨率。熒光的產(chǎn)生需要同時(shí)吸收兩個(gè)入射光子,這種非線性效應(yīng)使得雙光子顯微成像具有高分辨率、高對比度和光漂白只發(fā)生在焦點(diǎn)附近區(qū)域等優(yōu)點(diǎn)。另外,使用近紅外的飛秒激光作為激勵(lì)光源,雙光子熒光顯微成像技術(shù)不僅可以減少對生物樣品的光損傷,還可以獲得超過1000μm的成像深度,這也是該技術(shù)與共聚焦熒光顯微成像技術(shù)相比最主要的優(yōu)

2、勢。本文利用實(shí)驗(yàn)室飛秒摻鈦藍(lán)寶石激光器作為光源,在現(xiàn)有條件下搭建了一套雙光子熒光顯微成像系統(tǒng),并利用該系統(tǒng)開展了雙光子顯微成像研究。
　　理論上分析了雙光子激勵(lì)產(chǎn)生熒光的過程,利用公式推導(dǎo)證實(shí)了飛秒激光用于雙光子激勵(lì)的優(yōu)勢,計(jì)算結(jié)果表明當(dāng)平均功率相同時(shí),超短脈沖鎖模激光器作用下雙光子熒光的產(chǎn)率是連續(xù)光輸出激光器的105倍;討論了雙光子顯微成像技術(shù)中的飽和功率以及成像深度問題,得到了飽和激勵(lì)功率的表達(dá)式,并指出減小激光器輸出脈寬和重

3、頻可以有效提高雙光子顯微成像技術(shù)的穿透深度;利用菲涅耳衍射理論以及Richards和Wolf提出的高數(shù)值孔徑系統(tǒng)的衍射理論計(jì)算出雙光子熒光顯微成像技術(shù)的分辨率應(yīng)為亞微米量級。
　　實(shí)驗(yàn)上,首先完成了雙光子顯微成像探測器PMT高壓供電電源制作,并利用該電源測量了R3896型PMT的暗噪聲,結(jié)果顯示當(dāng)PMT供電電壓超過500V時(shí),暗噪聲顯著增大;利用PIN型光電二極管研制了一套激光能量診斷裝置,該裝置可以實(shí)時(shí)監(jiān)測入射激光能量的抖動(dòng);自

4、行編寫了掃描控制軟件,并利用該軟件和現(xiàn)有硬件搭建了一套雙光子顯微成像系統(tǒng),該系統(tǒng)中針對飛秒激光器受環(huán)境影響易出現(xiàn)失鎖及功率抖動(dòng)現(xiàn)象,提出利用光纖光譜儀和自制的能量診斷裝置實(shí)時(shí)監(jiān)測激光器輸出。然后測量了不同濃度RhodamineB溶液的單光子和雙光子熒光光譜,發(fā)現(xiàn)RhodamineB溶液的雙光子熒光光譜隨著濃度的增加,中心波長逐漸向其最大熒光發(fā)射波長610nm處靠近,半高寬逐漸增大;當(dāng)濃度較低時(shí),RhodamineB溶液的單光子和雙光子熒