CD15及CD133在不同級別膠質(zhì)瘤表達及其臨床意義的探討.pdf

1、一、研究背景
　　 腦腫瘤干細胞(BTSCs)是指腦腫瘤組織中存在著一小群具有很強的自我更新能力、分化功能強、能再成瘤、對常規(guī)的放化療有很強抵抗力的細胞，是腦腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的主要原因，其數(shù)量可能與腫瘤的惡性程度及預(yù)后存在相關(guān)性。基于腦腫瘤干細胞的靶向治療是目前研究的熱點之一。迄今為止，腦腫瘤公認(rèn)的干細胞特征的細胞(包括BTSCs)表面標(biāo)記物是CD133。最初研究報道認(rèn)為CD133是腦腫瘤干細胞的代名詞，或至少是一個先決條件

2、。然而，最近一系列研究報道表明，CD133可能不是這些細胞的絕對指標(biāo)。因為CD133對BTSCs具有高選擇性，而非高特異性，它同時也表達于胚胎及成人中樞神經(jīng)干細胞(NSCs)、血管內(nèi)皮前體細胞。CD133屬于糖復(fù)合物，由于糖復(fù)合物通常都定位于細胞表面，它們的表達通常會隨著細胞的發(fā)育發(fā)生大幅度的改變。此外，在正常的發(fā)育過程中，如果腫瘤起源于干/祖細胞不同點，從不同系列的膠質(zhì)瘤得來的腦腫瘤干細胞可能有不同的的免疫表型及其獨特的干細胞標(biāo)記物。

3、與造血干細胞類似的是，腦腫瘤干細胞的確定需要相應(yīng)標(biāo)記物的聯(lián)合應(yīng)用。因此尋求新的腦腫瘤干細胞標(biāo)記物就非常必須且迫切。2009年先后有學(xué)者報道在老鼠的髓母細胞模型中發(fā)現(xiàn)一種具干細胞特征的細胞，這些細胞表達表面標(biāo)記物CD15。研究人員通過不同的實驗表明CD15可以用來作為從腦腫瘤CD133-的細胞得來的腦腫瘤干細胞樣細胞(包括干細胞、祖細胞)的標(biāo)記。腦腫瘤干細胞標(biāo)記物CD15及CD133為抗腫瘤治療提供了新思路和可能的治療靶點，尤其CD15作

4、為新發(fā)現(xiàn)的腦腫瘤干細胞標(biāo)記物，可能為腦腫瘤基于腦腫瘤干細胞標(biāo)記物的治療提供一個新的切入點。本研究利用免疫組織化學(xué)法檢測腦腫瘤干細胞標(biāo)記物CD15和CD133的表達，探討腫瘤組織中CD15和CD133陽性細胞的存在、分布和臨床意義，為腦腫瘤干細胞標(biāo)記物的進一步研究打下基礎(chǔ)。
　　 二、研究目的
　　 檢測CD15及CD133在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達，探討兩種標(biāo)記物之間的相關(guān)聯(lián)系及其臨床意義。
　　 三、實驗方法

5、r>　　 1、材料與方法
　　 標(biāo)本的收集:80例膠質(zhì)瘤標(biāo)本來源于南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院病理科2008年至2010年存檔蠟塊。所有標(biāo)本均經(jīng)有經(jīng)驗的病理醫(yī)師復(fù)查確診，有詳細臨床、病理資料和隨訪資料。男45例，女35例，平均年齡35歲。嚴(yán)格按照WHO(2007)腦腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進行病理分類、分級:Ⅰ級10例，均為神經(jīng)元和混合性神經(jīng)元膠質(zhì)細胞腫瘤;Ⅱ級31例，其中少突膠質(zhì)細胞瘤13例，神經(jīng)元和混合性神經(jīng)元細胞腫瘤18例;Ⅲ級9例，其

6、中間變性少突膠質(zhì)細胞瘤7例，神經(jīng)元和混合性神經(jīng)元細胞腫瘤2例;Ⅳ級30例，其中髓母細胞瘤10例，膠質(zhì)母細胞瘤20例。Ⅰ-Ⅱ級為低級別膠質(zhì)瘤，Ⅲ-Ⅳ級為高級別膠質(zhì)瘤，其中高級別膠質(zhì)瘤39例，低級別膠質(zhì)瘤41例。
　　 采用非生物素免疫組織化學(xué)法檢測膠質(zhì)瘤組織中CD15和CD133的表達。使用Image-Pro Plus6.0圖像分析處理軟件計算CD15與CD133陽性細胞積分光密度(integrated optical densi

7、ty，IOD)，比較不同級別膠質(zhì)瘤CD15+細胞與CD133+細胞IOD值有無差別，同時進行CD)15+細胞與CD133+細胞IOD值相關(guān)分析。
　　 2、實驗步驟
　　 石蠟切片脫蠟和水化后，對組織抗原進行相應(yīng)的修復(fù)。蒸餾水沖洗2次，每次5min，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered saline，PBS)浸泡2次共10 min。加入過氧化物阻斷劑50-100μl阻斷滅活內(nèi)源性過氧化

8、物酶，室溫孵育10min。PBS液中沖洗3min×3次;甩去PBS液，滴加強力阻斷劑，室溫孵育10min;滴加一抗CD15或CD133(用PBS緩沖液代替一抗為陰性對照)，室溫孵育2小時;PBS液中沖洗5min×3次;甩去PBS液，滴加Super Enhancer液，室溫孵育15-20min;PBS液中沖洗3min×3次;甩去PBS液，滴加Polymer HRP試劑，室溫孵育15-30min;PBS液中沖洗3min×3次;甩去PBS液，

9、每張片滴加2滴新配制的DAB溶液(按說明書配制)，3～5min后顯微鏡下觀察顯色情況，充分顯色后終止反應(yīng)，流動自來水充分沖洗15min，蘇木素復(fù)染1min，酒精分化2秒鐘，流動自來水中沖洗10min以上，干燥，二甲苯透明，封片。
　　 3、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0軟件包，對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。每張切片選取具有代表性的腫瘤區(qū)域，在高倍鏡(400×)下隨機選擇5個視野，使用Image-Pro Plus6.0

10、圖像分析處理軟件計算出陽性細胞積分光密度(注:計算CD15陽性細胞積分光密度時去除CD15陽性中性粒細胞，計算CD133陽性細胞積分光密度時去除CD133陽性血管)。實驗數(shù)據(jù)用中位數(shù)(Median，M)表示。對CD15+細胞與CD133+細胞在不同級別膠質(zhì)瘤中的積分光密度值(IOD)組間的比較采用兩獨立樣本比較秩和檢驗(Wilcoxon秩和檢驗);CD15+細胞與CD133+細胞IOD之間的相關(guān)性分析采用Spearman法，P＜0.05

11、為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 四、結(jié)果
　　 1、CD15及CD133在膠質(zhì)瘤組織的表達形態(tài)多樣，基本形態(tài)主要如下:CD15陽性細胞形態(tài)有點狀陽性、核周圈狀陽性、短簇狀陽性及長簇狀陽性;CD133陽性細胞形態(tài)有胞漿和胞突狀陽性(有單極、雙極及多極)、核周胞漿空泡陽性、短簇狀陽性及長簇狀陽性。
　　 2、CD15及CD133的陽性表達在不同級別膠質(zhì)瘤組織的分布特征如下:CD15與CD133在不同級別的膠質(zhì)瘤均有表達，且C

12、D15+細胞與CD133+細胞的分布有一定規(guī)律性，CD15及CD133陽性細胞表達水平隨膠質(zhì)瘤病理分級增高而增高。低級別組CD133及CD15陽性細胞較少，多散發(fā)存在，CD133及CD15陽性壁龕較少;高級別組CD133及CD15陽性細胞多，聚集呈巢狀分布，且大部分分布于血管壁的周圍，繞血管放射狀分布，CD133及CD15陽性壁龕比較多。于CD133染色中，可見CD133陽性血管，這些CD133陽性血管的陽性CD133細胞考慮為內(nèi)皮前體

13、細胞;還可見CD133染色的特殊圖像，表現(xiàn)為假柵欄狀壞死及排列成軌道分布的圖像，前者的壞死位于CD133陽性細胞形成的假柵欄里面，這種壞死一般為不完全性壞死，后者為CD133陽性細胞圍繞著血管排列成軌道狀;含有肥胖細胞成分的膠質(zhì)瘤尚可見大量肥胖細胞CD133陽性。
　　 3、不同級別組膠質(zhì)瘤中CD15+細胞與CD133+細胞IOD值在不同級別組膠質(zhì)瘤中CD15+細胞IOD值分別為1879.96(高級別組)及430.43(低級別組

14、);在不同級別組膠質(zhì)瘤中CD133+細胞IOD值分別為3218.35(高級別組)及473.11(低級別組)，不同級別組膠質(zhì)瘤中CD15+細胞與CD133+細胞IOD值差異均有顯著性(z=-3.432, p=0.001;z=-4.192, p=0.000);
　　 4、CD15與CD133在不同級別膠質(zhì)瘤表達的相關(guān)性隨CD133陽性表達升高CD15陽性表達也有逐漸增高的趨勢。經(jīng)Spearman直線相關(guān)分析表明，CD15+細胞與CD

15、133+細胞IOD值呈顯著正相關(guān)(r=0.535，p=0.000)。
　　 五、結(jié)論
　　 1、CD15與CD133在不同級別的膠質(zhì)瘤均有表達，CD15及CD133陽性細胞數(shù)以及壁龕隨膠質(zhì)瘤病理級別增高而增高。并且，不同級別組膠質(zhì)瘤中CD15+細胞(p=0.001)與CD133+細胞(p=0.000) IOD值差異均有顯著性。
　　 2、CD15及CD133表達成正相關(guān)關(guān)系。經(jīng)Spearman直線相關(guān)分析表明，C