功能化納米鉆石藥物體系的構(gòu)建及其在腫瘤診療中的研究.pdf

1、由于人們不健康的生活習(xí)慣和惡劣環(huán)境影響，癌癥發(fā)病率逐年攀升，已經(jīng)成為人類的“死亡之神”。當(dāng)前癌癥治療主要依賴于化療手段，但由于化療藥物均缺乏特異識(shí)別和選擇性，易對人體引起較大毒副作用，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。納米技術(shù)出現(xiàn)為早日攻克癌癥提供了新的視野，通過功能化修飾納米材料，以物理或化學(xué)作用力負(fù)載抗腫瘤藥物，利用腫瘤組織和正常組織特性，將藥物靶向遞送至病變灶位，可實(shí)現(xiàn)對腫瘤的精準(zhǔn)診斷和高效治療。納米鉆石由于具有高

2、生物相容性，表面易于修飾等特點(diǎn)，已被廣泛用于基因和藥物輸送載體。但目前仍存在的弊端有載藥量低、靶向性較差和治療效率較低等。
　　針對上述問題，本論文以聚乙二醇化納米鉆石(ND-PEG)為載體，分別構(gòu)建了高負(fù)載和pH響應(yīng)納米鉆石藥物體系、溶菌酶響應(yīng)納米鉆石藥物體系以及葉酸介導(dǎo)的酸敏感靶向納米鉆石藥物體系。以肝癌、乳腺癌和宮頸癌細(xì)胞為體外模型，采用激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)等研究了納米藥物體系釋藥、入胞機(jī)制、抑制腫瘤等特性。以肝癌或

3、宮頸癌細(xì)胞構(gòu)建荷瘤裸鼠為體內(nèi)模型，研究了納米鉆石藥物體系體內(nèi)分布、抑瘤效應(yīng)和毒副作用等。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.在檸檬酸根(Cit3-)介質(zhì)中，獲得高負(fù)載化療藥物阿霉素(DOX)并對pH響應(yīng)的納米鉆石藥物體系(ND-PEG/DOX，NPDC)。發(fā)現(xiàn)其負(fù)載藥物量高達(dá)170±1.26μg/mg，是去離子水中吸附量的5.8倍。體外釋藥表明，在pH7.4條件下，經(jīng)過50h后，累積釋藥率僅為7％，而在pH5.0條件下，累積釋藥率顯著增加

4、到了80％，暗示該體系可提高抗腫瘤療效和降低對正常組織毒副作用。細(xì)胞攝取表明相對游離藥物DOX，NPDC可提高腫瘤細(xì)胞攝取量，細(xì)胞毒性測試表明NPDC能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且殺傷力強(qiáng)于游離DOX。此外，活體成像展示了NPDC可以通過EPR效應(yīng)靶向到腫瘤部位，藥物體系在腫瘤部位的累積是其它重要臟器的2倍多。重要的是，NPDC可以有效抑制腫瘤生長且抑制率為DOX的3.3倍，器官指數(shù)、血清生化指標(biāo)和組織切片病理學(xué)分析表明NPDC具有低毒性。

5、
　　2.當(dāng)前納米鉆石藥物體系主要基于物理作用力連接，但由于物理作用力會(huì)受各種因素影響，納米載藥體系進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)造成藥物過早釋放。因此，為提高藥物體系的穩(wěn)定性，以縮水甘油(GLY)為橋梁，將DOX以酯鍵偶聯(lián)于ND-PEG上獲得溶菌酶響應(yīng)納米鉆石藥物體系(ND-PEG-GLY-DOX，NPGD)。實(shí)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)NPGD在模擬的血液循環(huán)環(huán)境(pH7.4)中酯鍵難以水解（即使經(jīng)過110h，釋藥率僅為8％），導(dǎo)致藥物基本不釋放，不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)

6、(turn off)。但在模擬的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境(pH4.5和溶菌酶)，釋藥速率快且達(dá)到70％。通過激光共聚焦和流式細(xì)胞術(shù)表明其可通過小窩蛋白介導(dǎo)機(jī)制內(nèi)吞進(jìn)腫瘤細(xì)胞，位于溶酶體，利用過表達(dá)溶菌酶使其酯鍵發(fā)生斷裂，釋放出GLY-DOX，產(chǎn)生熒光信號(hào)(turn on)，繼而進(jìn)入核內(nèi)殺死腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤診療一體化。有趣的是，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明NPGD可有效抑制腫瘤生長，療效強(qiáng)于游離DOX。通過血清生化指標(biāo)和組織切片病理分析，展示了NPGD相對游離DOX

7、降低了毒副作用。
　　3.目前，臨床上應(yīng)用的傳統(tǒng)抗腫瘤藥物靶向性較差，因此亟需研發(fā)一種靶向性強(qiáng)、療效高和低毒副的靶向納米藥物體系。利用腫瘤組織和正常組織的差異，結(jié)合酸敏感的腙鍵和具有主動(dòng)靶向特性的葉酸，合成出了葉酸介導(dǎo)的共價(jià)偶聯(lián)pH響應(yīng)靶向納米鉆石藥物體系(ND-PEG-HYD-FA/-DOX，NPHF/D)。體外釋藥發(fā)現(xiàn)NPHF/D在生理環(huán)境(pH7.4)幾乎不釋放藥物，而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)核內(nèi)體環(huán)境(pH5.0)腙鍵水解斷裂，實(shí)現(xiàn)了

8、熒光的開-關(guān)傳感。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NPHF/D通過小窩蛋白和網(wǎng)格蛋白雙途徑?jīng)Q定、葉酸受體介導(dǎo)方式內(nèi)吞進(jìn)細(xì)胞，且內(nèi)吞量與細(xì)胞表面葉酸受體表達(dá)量有關(guān)。MTT測試和細(xì)胞凋亡表明葉酸靶向納米鉆石藥物體系對腫瘤細(xì)胞殺傷力大于非靶向納米鉆石藥物體系和游離藥物的殺傷力。吸引入的是，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NPHF/D通過被動(dòng)靶向和葉酸受體主動(dòng)靶向雙重作用靶向到腫瘤細(xì)胞，從而顯著提高抗腫瘤效應(yīng)，抑制率達(dá)到了87％，是游離藥物DOX(16％)的5.4倍，同時(shí)切