條斑紫菜R-藻紅蛋白熒光標(biāo)記抗體制備研究.pdf

1、R-藻紅蛋白熒光標(biāo)記抗體是一種新型的熒光探針，具有傳統(tǒng)熒光物無法比擬的優(yōu)越性，可應(yīng)用于熒光激活細(xì)胞分類、流式細(xì)胞儀熒光測定、熒光免疫檢測以及單分子檢測等多項(xiàng)技術(shù)，在醫(yī)學(xué)診斷、動植物檢疫、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等諸多領(lǐng)域中得到應(yīng)用。本論文主要從條斑紫菜R-藻紅蛋白提純、熒光標(biāo)記抗體的制備、優(yōu)化以及檢測技術(shù)等方面進(jìn)行了研究。主要研究內(nèi)容如下： 1.R-藻紅蛋白的純化與性質(zhì)鑒定本實(shí)驗(yàn)按照自行建立的流程成功地從紫菜中提取低成本高純度的R

2、—PE，為下一步制備廉價的R-藻紅蛋白熒光標(biāo)記物打下了基礎(chǔ)。并分別通過紫外光譜掃描、層析、電泳、結(jié)晶等方法對藻紅蛋白的性質(zhì)進(jìn)行鑒定。 紫外分光光度計(jì)檢測證明所得R-藻紅蛋白吸收光譜為雙峰型且純度達(dá)到4.6以上；而層析及非變性電泳都顯示只有一個峰及一個條帶，表明純度已達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求；結(jié)晶實(shí)驗(yàn)則表明：R-藻紅蛋白較適合結(jié)晶的pH大致在6.0左右，兩周后得到晶體，且在十周后仍未分解，所得晶體大小在0.02mm×0.02mm×0.1m

3、m左右，紅色，有折光現(xiàn)象，進(jìn)一步說明所得R-藻紅蛋白的純度較高；用激發(fā)光分別照射載玻片和硝酸纖維素膜上的條斑紫菜R-藻紅蛋呈橙黃色熒光，其結(jié)果證明其熒光特性良好，可用于熒光標(biāo)記檢測。 2.熒光標(biāo)記物制備方法研究本實(shí)驗(yàn)在確定所用實(shí)驗(yàn)材料及對材料性質(zhì)鑒定的基礎(chǔ)上，通過對于三種不同的交聯(lián)試劑對于R-PE的影響及不同交聯(lián)方法的比較，以確定蛋白交聯(lián)的方法包括反應(yīng)時間、試劑種類及濃度的控制及制備流程。 首先比較了不同濃度交聯(lián)試劑對藻

4、紅蛋白性質(zhì)及熒光強(qiáng)度的影響，發(fā)現(xiàn)戊二醛作用于R—PE較適合的濃度為0％-0.2％；高碘酸鈉作用于R—PE較適合的濃度為0-20mmol/L；而SPDP作用于R—PE較適合的摩爾比則為0-350。其次，分別選取0.2％的戊二醛、20mmol/L的高碘酸鈉與SPDP：R—PE為20進(jìn)行交聯(lián)產(chǎn)物的制備與檢測。最后通過對于各自層析圖和電泳圖的比較，發(fā)現(xiàn)由于戊二醛使用量的難以確認(rèn)及高碘酸鈉法易出現(xiàn)多聚合產(chǎn)物等原因，確定前兩種都不太適合用于R—PE

5、熒光標(biāo)記物的制備。只有SPDP&DTT組合法較適合熒光抗體的制備，并初步確定了制備流程，即用異功能試劑SPDP活化R—PE，DTT疏基化抗體，經(jīng)透析法分別去除溶液中多余的SPDP和DTT后混合交聯(lián)反應(yīng)，制備的熒光標(biāo)記混合物過凝膠層析柱，獲得R—PE熒光標(biāo)記的抗體。 3.R-藻紅蛋白熒光標(biāo)記物制備條件優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)在上一章研究的基礎(chǔ)上，以自制的高純度條斑紫菜R—PE為材料，著重探討緩沖液pH及反應(yīng)的溫度對于藻紅蛋白熒光性質(zhì)的影響、比較

6、了三種常用的蛋白濃縮法以及交聯(lián)試劑與物質(zhì)摩爾比對交聯(lián)效果的影響，對整個交聯(lián)過程進(jìn)行了條件優(yōu)化和質(zhì)量跟蹤，旨在初步制備高純度R—PE熒光標(biāo)記的第二抗(羊抗兔抗體)，為建立高質(zhì)量、低成本且簡便的熒光探針制備工藝奠定基礎(chǔ)。 首先，確定R-藻紅蛋白在交聯(lián)反應(yīng)時最好在低溫(5℃左右)、避光條件下進(jìn)行，而所選用的反應(yīng)緩沖液的pH值以6.8為適宜。其次，在三種蛋白濃縮方法中以超濾法對R—PE蛋白性質(zhì)影響最小且回收率高，所以選用超濾離心管對蛋白

7、進(jìn)行濃縮及脫鹽處理。最后通過一系列的比較實(shí)驗(yàn)確定了R—PE與SPDP按摩爾比為1：40進(jìn)行衍生化，同時以DTT與IgG摩爾比為500：1進(jìn)行巰基化。經(jīng)交聯(lián)過柱分離后所得的交聯(lián)產(chǎn)物與原方法相比不僅大大降低了交聯(lián)過程中的反應(yīng)物損失，而且顯著提高了交聯(lián)產(chǎn)率并已初步制成高純度產(chǎn)品。 4.R-藻紅蛋白熒光標(biāo)記物的應(yīng)用及免疫檢測技術(shù)在制備了高純度R-藻紅蛋白熒光標(biāo)記的第二抗(羊抗兔抗體)的基礎(chǔ)上，分別通過以NC膜為載體的免疫檢測、單細(xì)胞鹽藻

8、中的定位實(shí)驗(yàn)以及肝癌SMCC-7721細(xì)胞的檢測應(yīng)用等免疫檢測手段以確定制得R-藻紅蛋白熒光標(biāo)記抗體是否保持了良好的熒光性和特異性，為R—PE熒光探針的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。并在確定R-藻紅蛋白熒光標(biāo)記抗體的制備流程之后，初步探索藻藍(lán)蛋白(PC)熒光標(biāo)記抗體的制備條件及以NC膜為載體進(jìn)行免疫檢測。 通過以NC膜為載體的免疫檢測、單細(xì)胞鹽藻中的定位實(shí)驗(yàn)以及肝癌SMCC-7721細(xì)胞的檢測應(yīng)用等免疫檢測顯示對照組與檢測組區(qū)別明顯，證明了

9、經(jīng)優(yōu)化后所制備的R-藻紅蛋白熒光標(biāo)記抗體不僅特異性保持了完好而且熒光強(qiáng)度大完全能用于細(xì)胞中的免疫檢測。特別是對于SMCC-7721細(xì)胞的檢測，在綠色熒光激發(fā)下紅色細(xì)胞形態(tài)清晰完整，說明R-藻紅蛋白熒光標(biāo)記后的抗體能與一般腫瘤細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。 此外還基本建立了對于固相載體、懸浮細(xì)胞及貼壁細(xì)胞的熒光免疫檢測流程，初步確定在選用綠色濾光片檢測R-藻紅蛋白熒光標(biāo)記物能更好地保證免疫檢測的效果。而藻藍(lán)蛋白(PC)熒光標(biāo)記抗體制備與檢測