酪氨酸羥化酶的表達(dá)、純化及其活性研究.pdf

1、酪氨酸羥化酶是一類以L-Tyr為底物，通過在L-Tyr的苯環(huán)上發(fā)生鄰位羥基化生成L-DOPA的酶， L-DOPA是腦黑質(zhì)多巴胺生物合成的前體化合物，而多巴胺又是兒茶萘酚，去甲腎上腺素和腎上腺素的前體物質(zhì)。該酶是這些生物機(jī)體重要物質(zhì)合成的限速酶，對(duì)機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)及中央神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的影響。因此，對(duì)酪氨酸羥化酶的研究具有廣泛的醫(yī)學(xué)研究?jī)r(jià)值。人和大多數(shù)動(dòng)物機(jī)體中的酪氨酸羥化酶是以四氫生物喋呤作為其輔因子，只有少數(shù)的幾種細(xì)菌體內(nèi)的酪氨酸羥化酶

2、是以血紅素做為其輔因子，本課題中采用的就是一種以血紅素b作為其輔因子的酪氨酸羥化酶。該酶來源于S.refuineus，是該菌種合成安曲霉素的限速酶。
　　1.本課題通過分子生物學(xué)的常規(guī)方法構(gòu)建了酪氨酸羥化酶的pET-28a-Orf13的融合表達(dá)載體，并對(duì)其表達(dá)條件誘導(dǎo)溫度，溶氧量，誘導(dǎo)劑濃度，以及誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，并探究了不同表達(dá)條件下對(duì)酶活性的影響。得到了該酶的最適表達(dá)條件，即25℃，0.1 mM IPTG，裝液量為40％，誘

3、導(dǎo)8h，可以得到相對(duì)活性較高的酪氨酸羥化酶。
　　2.為了使酶的純化方法更簡(jiǎn)單，成本更低，本課題引入了類彈性蛋白純化標(biāo)簽ELP60，分別將ELP60連在Orf13的C末端和N末端，構(gòu)建了表達(dá)載體pET-Orf13-ELP60和pET-28a-ELP60-Orf13。并對(duì)其對(duì)酪氨酸羥化酶的活性影響進(jìn)行了探究，對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了一定的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)Orf13-ELP60的最適表達(dá)條件為25℃，0.2 mM IPTG，30％裝液量誘導(dǎo)8h可

4、以達(dá)到相對(duì)活性較高的酪氨酸羥化酶，ELP60-Orf13的最適表達(dá)條件為30℃，0.1 mM IPTG，40％裝液量誘導(dǎo)表達(dá)8h可以得到相對(duì)活性較高的酪氨酸羥化酶。并且還發(fā)現(xiàn)當(dāng)ELP60連在Orf13的C末端時(shí)其相對(duì)活性明顯高于將其連在Orf13的N末端，且其純化效果也相對(duì)較高。因此，試驗(yàn)中活性探索均采用Orf13-ELP60為目的蛋白進(jìn)行研究。
　　3.由于該酪氨酸羥化酶的催化過程中需要H2O2作為羥基供體，為了使反應(yīng)中持續(xù)提供

5、H2O2，試驗(yàn)中引入了D-氨基酸氧化酶(DAAO) DAAO以D-氨基酸為底物催化并生成H2O2，氨和相應(yīng)的α-酮酸鹽，因此DAAO的引入，可以使反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，直至底物L(fēng)-Tyr完全轉(zhuǎn)化。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)DAAO的引入極大的促進(jìn)了L-Tyr的轉(zhuǎn)化，使反應(yīng)可以在比較短是時(shí)間內(nèi)完成。為了使L-Tyr達(dá)到最大的轉(zhuǎn)化率，實(shí)驗(yàn)中對(duì)兩種底物L(fēng)-Tyr與D-Ala的不同的濃度比例進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)D-Ala的濃度低于L-Tyr濃度時(shí)，L-Tyr不能在短時(shí)間