酪氨酸羥化酶的表達、純化及其活性研究.pdf

1、酪氨酸羥化酶是一類以L-Tyr為底物，通過在L-Tyr的苯環(huán)上發(fā)生鄰位羥基化生成L-DOPA的酶， L-DOPA是腦黑質多巴胺生物合成的前體化合物，而多巴胺又是兒茶萘酚，去甲腎上腺素和腎上腺素的前體物質。該酶是這些生物機體重要物質合成的限速酶，對機體的神經系統(tǒng)及中央神經系統(tǒng)具有重要的影響。因此，對酪氨酸羥化酶的研究具有廣泛的醫(yī)學研究價值。人和大多數動物機體中的酪氨酸羥化酶是以四氫生物喋呤作為其輔因子，只有少數的幾種細菌體內的酪氨酸羥化酶

2、是以血紅素做為其輔因子，本課題中采用的就是一種以血紅素b作為其輔因子的酪氨酸羥化酶。該酶來源于S.refuineus，是該菌種合成安曲霉素的限速酶。
　　1.本課題通過分子生物學的常規(guī)方法構建了酪氨酸羥化酶的pET-28a-Orf13的融合表達載體，并對其表達條件誘導溫度，溶氧量，誘導劑濃度，以及誘導時間進行了優(yōu)化，并探究了不同表達條件下對酶活性的影響。得到了該酶的最適表達條件，即25℃，0.1 mM IPTG，裝液量為40％，誘

3、導8h，可以得到相對活性較高的酪氨酸羥化酶。
　　2.為了使酶的純化方法更簡單，成本更低，本課題引入了類彈性蛋白純化標簽ELP60，分別將ELP60連在Orf13的C末端和N末端，構建了表達載體pET-Orf13-ELP60和pET-28a-ELP60-Orf13。并對其對酪氨酸羥化酶的活性影響進行了探究，對其表達條件進行了一定的優(yōu)化，發(fā)現Orf13-ELP60的最適表達條件為25℃，0.2 mM IPTG，30％裝液量誘導8h可

4、以達到相對活性較高的酪氨酸羥化酶，ELP60-Orf13的最適表達條件為30℃，0.1 mM IPTG，40％裝液量誘導表達8h可以得到相對活性較高的酪氨酸羥化酶。并且還發(fā)現當ELP60連在Orf13的C末端時其相對活性明顯高于將其連在Orf13的N末端，且其純化效果也相對較高。因此，試驗中活性探索均采用Orf13-ELP60為目的蛋白進行研究。
　　3.由于該酪氨酸羥化酶的催化過程中需要H2O2作為羥基供體，為了使反應中持續(xù)提供

5、H2O2，試驗中引入了D-氨基酸氧化酶(DAAO) DAAO以D-氨基酸為底物催化并生成H2O2，氨和相應的α-酮酸鹽，因此DAAO的引入，可以使反應持續(xù)進行，直至底物L-Tyr完全轉化。試驗中發(fā)現DAAO的引入極大的促進了L-Tyr的轉化，使反應可以在比較短是時間內完成。為了使L-Tyr達到最大的轉化率，實驗中對兩種底物L-Tyr與D-Ala的不同的濃度比例進行了研究，發(fā)現當D-Ala的濃度低于L-Tyr濃度時，L-Tyr不能在短時間