小鼠胚胎干細胞系的建立與體外誘導向生殖細胞分化研究.pdf

1、小鼠胚胎干細胞（embryonicstemcells）是由囊胚內(nèi)細胞團在體外培養(yǎng)條件下建立的多能性干細胞系，具有形成嵌合體的能力，并能發(fā)育為嵌合體的任何組織、細胞類型，包括生殖細胞。胚胎干細胞在體外也能自發(fā)分化形成三個胚層的細胞;在特定誘導條件下，能分化成肌肉、神經(jīng)、胰島等細胞類型。特別地，胚胎干細胞在一定條件的誘導下，可以體外向生殖細胞分化。
　　生殖系的發(fā)育是大多數(shù)物種全能性（受精卵）和子代產(chǎn)生的源頭。在小鼠中，生殖系發(fā)育起始

2、于原生殖細胞(primodialgermcells)在胚胎發(fā)育第7天的出現(xiàn);而這一過程受到了精密的細胞信號調(diào)控，特別是BMP4/Smads和SCF/c-Kit信號通路，前者對于原生殖細胞發(fā)育、后者對于原生殖細胞生長是必須的。無論雌雄，原生殖細胞都是最終的生殖細胞——卵母細胞和精子——的來源。在雄性小鼠，原生殖細胞在特化后遷移到發(fā)育中的雄性生殖脊，最終形成精原干細胞(spermatogonialstemcells)，通過減數(shù)分裂維持整個雄

3、性小鼠成年后的生精過程。
　　本研究擬利用細胞因子誘導小鼠胚胎干細胞在體外條件下向生殖脊分化。首先，C57BL/6J雌鼠與Oct4-EGFP轉(zhuǎn)基因雄鼠（ES-4N）交配后，分離其囊胚，建立胚胎干細胞系。不同的培養(yǎng)條件下，小鼠胚胎干細胞建系的效率明顯不同，在2i-LIF培養(yǎng)基中效率最高，且干細胞維持基態(tài)(groundstate)。
　　為了使得胚胎干細胞在最終分化為精子后便于分離、觀察、鑒定，對小鼠胚胎干細胞進行了精子特異性熒

4、光標記的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了pAcr-DsRed重組載體。載體啟動子為頂體素基因(Acr)的啟動子，其在減數(shù)分裂以后的精子細胞中開始表達，因此可以用來特異性標記精子。將重組載體電轉(zhuǎn)染胚胎干細胞，經(jīng)G418篩選出陽性克隆后，制備嵌合體小鼠。
　　利用細胞因子對小鼠胚胎干細胞進行誘導分化。首先利用bFGF和ActivinA誘導胚胎干細胞向表胚層細胞(epiblast)分化;再用BMP4和SCF誘導其向生殖細胞分化。實驗結(jié)

5、果顯示，在BMP4和SCF的作用下，胚胎干細胞向生殖系分化，相關(guān)特異性蛋白在誘導后的轉(zhuǎn)錄水平明顯上升。BMP4單獨作用也可得到類似的結(jié)果，而SCF單獨作用不能誘導胚胎干細胞向生殖系分化。這與生殖系在體內(nèi)發(fā)育時的信號調(diào)控通路是一致的。
　　綜上所述，小鼠胚胎干細胞在體外建系時，2i-LIF培養(yǎng)體系是最為高效的;在轉(zhuǎn)染了精子特異性標記后，胚胎干細胞仍具有全能性，這為研究胚胎干細胞向生殖系發(fā)育提供了很好的實驗基礎(chǔ)。體外誘導分化實驗表明，