鱖NKAP和VIP的初步功能研究.pdf

1、鱖是我國(guó)重要的魚類養(yǎng)殖品種，而近年來(lái)傳染性脾腎壞死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus，ISKNV)對(duì)鱖養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了研究病毒與宿主的相互作用，本論文應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建了ISKNV感染鱖在發(fā)病過(guò)程中不同時(shí)期的脾臟差異表達(dá)基因文庫(kù)，其中2個(gè)正向庫(kù)Tester分別為在發(fā)病初期鱖脾——感染4天，及病重瀕死鱖脾——感染11天，各以注射PBS組和康復(fù)組為Driver；

2、2個(gè)反向庫(kù)則為Tester和Driver與相應(yīng)正向庫(kù)互換。隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定、測(cè)序及同源性分析，并以半定量RT—PCR進(jìn)行驗(yàn)證。測(cè)序和拼接后獲得407個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽，從中篩選和鑒定了144多個(gè)差異表達(dá)的基因片段，已遞交Genbank登記。這些差異表達(dá)的基因片段包括免疫相關(guān)的蛋白和酶、信號(hào)調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)因子、凋亡相關(guān)、消化和代謝、轉(zhuǎn)錄和合成、細(xì)胞骨架、核糖體相關(guān)和未知功能的EST；其中，成員最多的是免疫相關(guān)的蛋白和酶基因類。

3、 NF—кB激活蛋白(NF—кB activating protein，NKAP)經(jīng)RACE所得的cDNA全長(zhǎng)1612 bp，編碼432aa、預(yù)期大小為50.34 kDa的蛋白，序列比對(duì)表明其為一進(jìn)化上高度保守的蛋白。在ISKNV感染的過(guò)程中，鱖NKAP(mfNKAP)在轉(zhuǎn)錄水平上有小幅下調(diào)。EGFP融合的mfNKAP定位于細(xì)胞核，并能引起細(xì)胞染色質(zhì)強(qiáng)烈固縮，激光掃描共聚焦顯微鏡下清晰可見轉(zhuǎn)染mfNKAP48h的細(xì)胞核形成凋亡小體。通

4、過(guò)NF—кB雙螢光報(bào)告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染mfNKAP的293T細(xì)胞中，不論是否用TNFα刺激，mfNKAP都能夠激活NF—кB的活性，并能增加p50在胞質(zhì)中的含量。在TFV感染過(guò)程中，mfNKAP過(guò)表達(dá)FHM細(xì)胞比對(duì)照組相應(yīng)的細(xì)胞病理變化出現(xiàn)時(shí)間推遲了8h。顯示mfNKAP有一定的抗病毒能力。 鱖VHSV誘導(dǎo)蛋白(mandarin fish VHSV—induce protein—like protein，mfVIP)經(jīng)RACE所

5、獲得的全長(zhǎng)cDNA有兩個(gè)拷貝，短的序列長(zhǎng)度為1265bp，長(zhǎng)的序列長(zhǎng)度為1307 bp，編碼155aa、預(yù)期大小為17.45 kDa的蛋白。生物信息學(xué)分析認(rèn)為VIP為—含IG—like結(jié)構(gòu)域、膜上有定位的蛋白，并有廣泛的細(xì)胞亞定位。通過(guò)綠色熒光蛋白和間接細(xì)胞免疫熒光等方法分析mfVIP的亞細(xì)胞定位，并確認(rèn)了其在細(xì)胞膜上有定位。在ISKNV感染的過(guò)程中，mfVIP在鱖多種組織里的轉(zhuǎn)錄水平上明顯增加?；貧w感染實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)注射pET—mfVI

6、P重組蛋白和ISKNV可加速病鱖死亡；而印片結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組(I+mf)比ISKNV感染對(duì)照組的脾臟腫大細(xì)胞少；芯片數(shù)據(jù)顯示I+mf組的免疫球蛋白、趨化因子IL—8、CC chemokine、MIP-1或與細(xì)胞因子分泌表達(dá)調(diào)控相關(guān)的蛋白JFC/EBPb、Ikaros、HLA—G以及與蛋白合成降解代謝相關(guān)等蛋白基因被上調(diào)表達(dá)，表明mfVIP在激活宿主免疫系統(tǒng)、刺激細(xì)胞因子方面有強(qiáng)烈作用。通過(guò)GST pull—down實(shí)驗(yàn)推測(cè)mfVIP與翻譯

7、延伸因子1α相結(jié)合。 通過(guò)RT-PCR報(bào)道了斑馬魚VIP的存在，zfVIP在斑馬魚的脾臟、腸、心臟、性腺中含量較高，鰓中有微弱擴(kuò)增，肌肉和肝臟中檢測(cè)不出來(lái)；實(shí)時(shí)熒光PCR顯示在胚胎發(fā)育0h時(shí)zfVIP的就有一定的轉(zhuǎn)錄水平存在，1h稍為升高，其后一直下降，到16h后幾乎不表達(dá)，成魚后才開始逐步恢復(fù)表達(dá)，因此認(rèn)為zfVIP在胚胎中極有可能為母源性因子。ISKNV感染后，zfVIP mRNA在斑馬魚脾臟中含量增加，到第6天為表達(dá)最高峰