簡介：分子生物學(xué)研究策略,3、基因分子生物學(xué)的基本技術(shù)31基因的分子雜交技術(shù)32基因的擴增技術(shù)（PCR）33基因的突變技術(shù)（轉(zhuǎn)座技術(shù)）34基因的表達技術(shù)（表達系統(tǒng)）35轉(zhuǎn)基因技術(shù)（轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物）36微陣列分析,基因表達系統(tǒng),1、大腸桿菌表達系統(tǒng)2、芽孢桿菌表達系統(tǒng)3、乳酸菌基因表達系統(tǒng)4、鏈霉菌基因表達系統(tǒng)5、酵母菌表達系統(tǒng)6、絲狀真菌表達系統(tǒng)7、昆蟲表達系統(tǒng)8、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)9、植物生物反應(yīng)器,1、大腸桿菌表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMINECOLI）,1）大腸桿菌表達系統(tǒng)的特點（1）遺傳背景清楚（2）目的基因表達水平高（3）培養(yǎng)周期短（4）抗感染能力強,2）大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢,完善現(xiàn)有的表達系統(tǒng)；重組蛋白質(zhì)的正確折疊；構(gòu)象形成；蛋白質(zhì)的分泌；菌體表面表達技術(shù)及其應(yīng)用；重組蛋白質(zhì)修飾加工。,真核基因在不同表達系統(tǒng)的表達,表達白細胞介素IL3成熟蛋白大腸桿菌表達系統(tǒng)2030U地衣芽孢桿菌表達系統(tǒng)250300U酵母菌表達系統(tǒng)20U哺如動物細胞2U,2、芽胞桿菌表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMINBACILLUS）,1）特點枯草芽孢桿菌是非致病的土壤微生物，嚴格生長在有氧條件下?？莶菅挎邨U菌遺傳學(xué)相當先進，很多噬菌體和質(zhì)粒適合用作克隆載體。芽孢桿菌可大量產(chǎn)生幾種商品酶，如?淀粉酶，蛋白酶及蘇云金桿菌的殺蟲晶體蛋白等，發(fā)酵技術(shù)發(fā)達。具有單層細胞膜組成較簡單的細胞外殼。易于分離純化分泌蛋白,2）枯草桿菌宿主菌株由于大腸桿菌的CACL2轉(zhuǎn)化法對枯草芽孢桿菌無效（1）選擇可轉(zhuǎn)化的菌株168菌株及突變體營養(yǎng)要求、芽孢形成和萌發(fā)、蛋白酶缺失、重組缺陷、限制/修飾系統(tǒng)缺陷、轉(zhuǎn)座子插入（2）選擇轉(zhuǎn)化的方法感受態(tài)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化甘氨酸添加培養(yǎng)感受態(tài)其它方法，如轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合轉(zhuǎn)移,3）、可作為宿主的其它菌種嗜堿芽孢桿菌BACILLUSABCALOPHILUS蛋白酶淀粉芽孢桿菌BACILLUSAMYLOLIQUEFACILUS?淀粉酶短芽孢桿菌BACILLUSBREVIS地衣芽孢桿菌BACILLUSLICHENIFORMIS淀粉酶，抗真菌肽巨大芽孢桿菌BACILLUSMEGATERIUM淀粉酶短小芽孢桿菌BACILLUSPUMILUS蛋白酶,球形芽孢桿菌BACILLUSSPHAERICUS滅蚊毒素蛋白嗜熱芽孢桿菌BACILLUSSTEAROTHERMOPHILUS高溫?淀粉酶蘇云金芽孢桿菌BACILLUSTHURINGIENSIS殺蟲晶體蛋白耐堿的芽孢桿菌BACILLUSALCALOPHILIC堿性蛋白酶炭疽芽孢桿菌BACILLUSANTHRACIS,4）枯草芽胞桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢,1、表達真核基因蛋白酶水解缺陷型、抑制劑2、表達商業(yè)用酶克隆基因的整合3、表達殺蟲晶體蛋白提高殺蟲毒力，減少殺蟲時間，增加廣譜4、利用芽孢桿菌基因工程技術(shù)擴大和加強在醫(yī)藥領(lǐng)域多個方面的應(yīng)用,3、乳酸菌基因表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMINLACTICACIDBACTERIA）,1）特點乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。大多數(shù)不運動，少數(shù)以周毛運動。菌體常排列成鏈。在其發(fā)酵產(chǎn)物中只有乳酸的稱為同型乳酸發(fā)酵，而產(chǎn)物中除乳酸外還有較多乙酸、乙醇、CO２等物質(zhì)的稱為異型乳酸發(fā)酵。有微好氧菌和專性厭氧菌。,LACTICACIDBACTERIA,GENERASTREPTOCOCCUSLEUCONOSTOCPEDIOCOCCUSLACTOBACILLUSENTEROCOCCUSLACTOCOCCUS,ALLTHEABOVEGENERAGROWINCHAINSMANYAREUSEDFORTHEFOODINDUSTRY,2）理想乳酸菌表達載體的特征1、穩(wěn)定的遺傳、傳代能力（復(fù)制子）2、具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標記（EMR）3、啟動子的轉(zhuǎn)錄是可以調(diào)控4、具有多克隆酶切位點,3）研究進展,（1）食品發(fā)酵方面的應(yīng)用,（2）乳酸菌菌種鑒定REA（RESTRICTIONENDONUCLEASEANALYSIS）16SRRNA（PCR）SDSPAGE,（3）抗微生物和食品腐敗,（4）細胞表面層和外多糖利用生物異構(gòu)化方法從亞油酸生產(chǎn)具有生理活性的共軛亞油酸（CLA）異構(gòu)體單體。篩選到一株產(chǎn)生9順,11反共軛亞油酸的乳桿菌L1，建立了亞油酸制備技術(shù)，CLA小試發(fā)酵工藝，共軛亞油酸的HPLC純化分離和毛細管電泳鑒定技術(shù)。,（5）蛋白質(zhì)降解、多肽降解和脂降解,（6）分子遺傳學(xué)基因克隆表達調(diào)控染色體分析,（7）益生菌（PROBIOTICS）LACTOBACILLUSANDBIFIDOBACTERIUM,食品級基因修飾菌是指被導(dǎo)入源于同種或公認的安全的食品級微生物的基因，因此具有某種優(yōu)良性狀的用于發(fā)酵食品生產(chǎn)的微生物。1、功能性基因必須源于同種菌或公認的安全的食品級微生物；2、載體必須是食品級的，不得含有非食品級的功能性DNA片段；3、選擇性標記不得選用各種抗生素抗性標記。應(yīng)選用食品級的標記基因，如糖類利用標記、營養(yǎng)缺陷型標記等；4、宿主菌的遺傳特性清楚且穩(wěn)定，具有足夠的安全性，應(yīng)選用適當?shù)姆肿由飳W(xué)方法如DNA序列分析、雜交等確定宿主菌的遺傳組成。,食品級載體不但是GRAS微生物，而且不依靠抗生素抗性作為選擇標記，因而更為安全，在食品、醫(yī)藥方面具有廣泛的應(yīng)用潛力。乳酸菌的食品級高效誘導(dǎo)分泌表達NICE系統(tǒng)是可控制的蛋白質(zhì)生產(chǎn)的最理想的系統(tǒng)。,4、鏈霉菌基因表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMINSTREPTOMYCES）,1）特點大多數(shù)來自于土壤能形成孢子的革蘭氏陽性菌有復(fù)雜的形態(tài)（以無中隔分枝菌絲方式生長）和生理生命周期產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物基因組是大腸桿菌的兩倍，GC含量高，平均為74,2）鏈霉菌的載體（1）高拷貝載體PIJ10140800拷貝硫鏈絲菌素（TSR），新霉素（NEO），酪氨酸酶（MEL）（2）低拷貝載體PIJ92012拷貝廣泛宿主能插入大于30KB的片段（3）穿梭載體PHJL210（SCP2/PBR322）（4）柯斯載體（COSMID）構(gòu)建基因文庫,（5）接合轉(zhuǎn)移載體PBR322/PIJ101/RK2（INCP）（轉(zhuǎn)移功能）（6）噬菌體載體?C31衍生的，如KC304，KC505（7）表達載體利用PTIPA啟動子構(gòu)建的表達載體PIJ6021（8）分泌載體利用SLONGISPORUS分泌的枯草桿菌素抑制劑SUBTILISIN（SSI）分泌和抑制絲氨酸蛋白酶特性構(gòu)建如PIJ702,（9）其他載體（A）大容量載體細菌人工染色體BAC利用F因子復(fù)制起始點/PAR元件，12拷貝，克隆100300KB的片段（B）整合型載體利用PSAM2整合元件構(gòu)建的PPM927（C）高表達載體整合高表達載體PCJR24，是利用天藍色鏈霉菌A3中的激活調(diào)節(jié)基因ACTIIORF4與ACTI基因啟動子構(gòu)建的,3）鏈霉菌基因轉(zhuǎn)移的方法（1）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化率不高,制備過程中影響因素多,系統(tǒng)對外源DNA的限制修飾作用（2）接合轉(zhuǎn)移DNA以單鏈形式進入宿主菌大腸桿菌S171菌株,質(zhì)粒RSF1010（3）電脈沖穿孔轉(zhuǎn)化率比原生質(zhì)體高10100倍（4）噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo),4）鏈霉菌基因的調(diào)控和蛋白質(zhì)的分泌表達,（1）RNA聚合酶基因多樣性天藍色鏈霉菌有兩種不同形式的RNA聚合酶全酶?32（與大腸桿菌有保守性）和?49（發(fā)育階段）多?因子,雙啟動子研究表明天藍色鏈霉菌至少有7個不同的?因子,參與營養(yǎng)期,孢子形成,次級代謝等,（2）調(diào)節(jié)基因A、途徑專一調(diào)節(jié)基因（PATHWAYSPECIFICREGULATOR）具有鏈霉菌調(diào)節(jié)蛋白新家族SARP正調(diào)控因子B、全局調(diào)節(jié)基因（GLOBALREGULATOR）調(diào)控所有抗生素生物合成的調(diào)節(jié)基因ABSA編碼雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（3）調(diào)節(jié)因子小分子脂溶兼水溶的Γ丁酰內(nèi)酯作為激素樣物質(zhì)激發(fā)次級代謝和/或氣生菌絲的形成,（4）鏈霉菌中的蛋白外泌系統(tǒng)蛋白分泌機制大多數(shù)鏈霉菌的外泌蛋白前蛋白中有N端信號序列，它們的外泌依靠SEC介導(dǎo)的分泌系統(tǒng)?，F(xiàn)已從鏈霉菌中已克隆了SECA，SECY，SECD，SECE和SECF類似物。SECABLANCOETAL1998屬于膜相關(guān)的轉(zhuǎn)位ATPASE,它阻止分泌前蛋白形成三級結(jié)構(gòu)前體，促進前蛋白定位于分泌的轉(zhuǎn)位酶上。,蛋白的轉(zhuǎn)位和穿膜鏈霉菌中蛋白的轉(zhuǎn)位與穿膜機制尚未搞清，如將IL2與TENDAMISTAT信號肽融合，在鏈霉菌中只有1/20翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)位（TRANSLOCATION）至培養(yǎng)基和積累在胞內(nèi)。,5）影響鏈霉菌中基因表達的因素,（1）啟動子對外源基因表達的影響（2）信號肽對外源蛋白分泌的影響A、信號肽N末端氨基酸序列正電荷數(shù)對基因表達的影響B(tài)、信號肽切割位點后的氨基酸數(shù)對基因表達的影響C、信號肽和目的蛋白之間的距離對基因表達的影響,（3）密碼子、SD序列和終止子等對基因表達的影響鏈霉菌中翻譯起始密碼子為ATG或GTG，終止密碼子為TAA或TAG（4）DNA擴增序列對基因表達的影響（5）發(fā)酵條件對外源基因表達的影響,6）鏈霉菌表達系統(tǒng)優(yōu)缺點及研究發(fā)展趨勢,（1）優(yōu)點鏈霉菌工業(yè)化培養(yǎng)條件成熟,適合于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化鏈霉菌基本為非致病菌,不產(chǎn)生內(nèi)毒素可以進行高密度培養(yǎng),在穩(wěn)定期仍能維持異源蛋白的產(chǎn)生鏈霉菌可分泌胞外酶,利用信號肽可分泌外源蛋白鏈霉菌中有許多可利用的轉(zhuǎn)錄起始信號,利用它可以高表達外源基因,（2）缺點由于研究鏈霉菌表達有生物活性的真核來源的蛋白還處于初級階段,許多實驗結(jié)果不具有普遍規(guī)律,存在的問題有下列方面高活性啟動子信號肽切割位點的氨基酸序列蛋白酶的水解次級代謝可控制啟動子翻譯后加工,（3）研究發(fā)展趨勢結(jié)合基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué),完善基因表達系統(tǒng)優(yōu)化組合強啟動子,信號和先導(dǎo)肽,從分子水平研究其結(jié)構(gòu)元件與功能的關(guān)系在蛋白水平研究蛋白的分泌機理,特別是蛋白的轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)膜機制研究次級代謝產(chǎn)物生物合成酶系的結(jié)構(gòu),構(gòu)建新化合物文庫,用于新藥的開發(fā),5、酵母菌表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMINYEAST）,1996年，完成了酵母基因組DNA（125X107BP全序列測定工作。,DIVISIONBUDDINGDONOTFORMFILAMENTSSOMEFORMFILAMENTSSOMECANMATE,1）酵母菌基因表達系統(tǒng)的宿主特點（1）安全無毒,不致病。（2）有較清楚的背景,容易遺傳操作。（3）容易進行載體DNA的導(dǎo)入。（4）培養(yǎng)條件簡單，容易進行高密度發(fā)酵。（5）有良好的蛋白質(zhì)分泌能力。（6）有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾功能。,2）釀酒酵母（SACCHAROMYCESCEREVISIAE）,釀酒酵母是最早發(fā)展的真核基因表達系統(tǒng)。已表達和生產(chǎn)乙型肝炎疫苗、人胰島素、干擾素等。釀酒酵母的不足之處（1）發(fā)酵時會產(chǎn)生乙醇，乙醇的積累會影響酵母本身的生長，因此較難進行高密度發(fā)酵。（2）蛋白質(zhì)的分泌能力較差。（3）雖然能進行蛋白質(zhì)的糖基化修飾，但是與高等真核生物的相比，所形成的糖基側(cè)鏈太長。過度的糖基化會引起副作用。,3）畢赤酵母（PICHIAPASTORIS）,優(yōu)點（1）可以使發(fā)酵密度達到很高的水平；（2）分泌外源基因表達產(chǎn)物的能力強；（3）糖基化修飾功能更接近高等真核生物。不足分子生物學(xué)的研究基礎(chǔ)差，要對其進行遺傳改造困難較大；不是一種食品微生物，發(fā)酵時又要添加甲醇，所以要用它來生產(chǎn)藥品或食品還沒有被廣泛接受。發(fā)酵雖然能達到很高的密度，發(fā)酵周期一般較長。,4）酵母表達系統(tǒng)研究進展,（1）外源基因在酵母中的高表達（A）提高和控制外源基因的轉(zhuǎn)錄水平強啟動子磷酸甘油酸激酶基因的啟動子（PGK1）營養(yǎng)調(diào)節(jié)啟動子碳源調(diào)控的GAL1，GAL10基因，無機磷調(diào)控的POH5基因溫控調(diào)節(jié)啟動子SIR3基因,（B）提高表達載體的在細胞的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性酵母菌的內(nèi)源質(zhì)粒野生型2Μ質(zhì)粒核糖體DNARDNA介導(dǎo)的多拷貝整合單拷貝DNA片段HIS4或AOX1介導(dǎo)（C）提高外源基因在酵母系統(tǒng)表達水平的其它因素蛋白質(zhì)分泌的調(diào)控翻譯效率；酵母偏愛密碼子；蛋白酶降解；發(fā)酵密度,（2）提高外源基因表達產(chǎn)物的的質(zhì)量（A）表達系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性（B）胞內(nèi)表達產(chǎn)物的加工和修飾（C）分泌表達產(chǎn)物的加工和修飾（3）酵母表達系統(tǒng)的新應(yīng)用（A）酵母表達系統(tǒng)在人類基因組研究中應(yīng)用A）人類基因的功能分析（B）人類蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜分析（C）人類分泌蛋白質(zhì)和受體基因的快速篩選（B）酵母表達系統(tǒng)在藥物研究中的應(yīng)用,6、絲狀真菌表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMINFILAMENTOUSFUNGI）,1）載體特點天然質(zhì)粒，多數(shù)為線性，僅在粗糙鏈孢霉發(fā)現(xiàn)有環(huán)狀質(zhì)粒。目前使用的載體還是以細菌質(zhì)粒為基本結(jié)構(gòu)。1、營養(yǎng)選擇性標記ARGB（精氨酸原養(yǎng)型）和AMDS（乙酰胺利用）2、顯性選擇性標記G418（氨基糖苷類抗生素）3、啟動子從真菌基因組中篩選強啟動子,如CBH1（纖維素生物水解酶）GPD（甘油醛3磷酸脫氫酶）,轉(zhuǎn)化方法（1）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化裂解酶NOVOZYME234，或與?葡萄醛酸糖苷酶混合使用；滲透壓穩(wěn)定劑（如氯化鎂等無機鹽或山梨醇、蔗糖等糖）；聚乙二醇（PEG）轉(zhuǎn)化率低，僅為1030轉(zhuǎn)化子/UGDNA（2）電擊轉(zhuǎn)化?葡萄醛酸糖苷酶預(yù)處理，電擊條件，125KV/CM,電容25?F,電阻400?。（3）共轉(zhuǎn)化兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化在絲狀真菌中有較高的整合頻率。一個質(zhì)粒攜帶目的基因，另一個有篩選標記。所篩選的轉(zhuǎn)化子中90含有目的基因。,2）基因的結(jié)構(gòu)和功能,真菌的核通常為單倍體核，基因組小，約為大腸桿菌的7倍，酵母菌的2倍，僅為人類基因組的1（一）基因轉(zhuǎn)錄（1）5’非編碼區(qū)核心啟動子單元,（2）CAAT保守序列較高等的真核生物中，常在位于80BP處，發(fā)現(xiàn)GC（C/T）CAATCT保守序列，絲狀真菌常位于100～200BP區(qū)。（3）TATA保守序列常位于轉(zhuǎn)錄啟始點上游40～100BP,（4）CT含量豐富區(qū)常位于10～60BP（平均20BP）（5）轉(zhuǎn)錄起始點通常有2個以上的轉(zhuǎn)錄啟始點（6）轉(zhuǎn)錄加工和翻譯帽子結(jié)構(gòu)（CAP），A?U?G?C5‘端不翻譯MRNA約5～300BP，通常30～70BP,,,,,CAAT,TATA,CT,,TSP,,ATG,（7）內(nèi)含子68的絲狀真菌的基因含有內(nèi)含子大多數(shù)的拼接位點5‘端GTPUNGPY3’端PYAG（8）3’非編碼區(qū)POLYA寡聚物,3）次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn),（一）Β內(nèi)酰胺抗生素青霉素、頭孢菌素C（1）、生物合成基因克隆和調(diào)控研究（A編碼ACV合成酶的基因ACVAPCBAB（?氨基己二酸半胱氨酸頡氨酸合成酶）葡萄糖調(diào)控，磷酸鹽調(diào)控，銨調(diào)控（B）異青霉素N合成酶基因IPNAPCBC,（C）異青霉素N?；o酶A?；D(zhuǎn)移酶IAT的基因AATAPENDE（D）脫乙酰氧頭孢菌素C合成酶/羥化酶DAOC/DAC雙功能基因CEFEF（E）編碼乙?；鵆OADAC乙?；D(zhuǎn)移酶的基因CEFG,2、應(yīng)用A增加基因量提高產(chǎn)量B引入血紅蛋白基因增加抗生素產(chǎn)量C工程菌直接合成7ACA或7ADCA（二）多肽代謝物具有抗微生物和其他藥理學(xué)活性如線狀多肽由綠色木霉產(chǎn)生的丙甲菌素,4）發(fā)展趨勢,1、通過基因工程技術(shù)改良絲狀真菌表達系統(tǒng)，擴大遺傳背景的深入了解。2、研究絲狀真菌自身的自我復(fù)制序列，提高DNA轉(zhuǎn)化率。3、研究轉(zhuǎn)錄水平，翻譯水平和翻譯后加工的調(diào)控，增加產(chǎn)量。4、研究代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)關(guān)鍵點，最大限度的表達次級代謝產(chǎn)物，胞外酶，外源蛋白,昆蟲表達系統(tǒng)是一類應(yīng)用廣泛的真核表達系統(tǒng)，它具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾、加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。利用重組桿狀病毒在昆蟲細胞系中表達外源蛋白是目前較為流行的表達系統(tǒng)，而另一類新型的昆蟲細胞表達系統(tǒng)，則是建立在對果蠅等昆蟲細胞進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)之上的，在穩(wěn)定性和表達效率方面有著更為突出的優(yōu)點。,7、昆蟲細胞表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMININSECTCELLS）,目前使用桿狀病毒表達系統(tǒng)克隆和表達了許多外源基因，例如H5N1亞型禽流感病毒血凝素、人骨形成蛋白2、人類細小病毒B19殼蛋白VP2，人尿激酶原CDNA、信號肽引導(dǎo)源基因等?？贵w分子有鼠源單克隆抗體、人鼠嵌合抗體、單鏈抗體及人單克隆抗體等多種抗體分子，還將抗體分子與尿激酶型纖溶酶原激活物等腫瘤相關(guān)蛋白進行了融合表達，這些抗體分子多數(shù)能正確組裝，完成糖基化過程，具有相當?shù)幕钚浴?1）昆蟲表達系統(tǒng)的特點,重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能為高表達的外源蛋白在細胞內(nèi)進行正確折疊、二硫鍵的搭配及寡聚物的形成提供良好的環(huán)境，可使表達產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白。能進行翻譯后的加工修飾對蛋白質(zhì)進行完整的翻譯后加工，包括糖基化、磷酸化、?；⑿盘栯那谐半亩蔚那懈詈头纸獾?，修飾的位點與天然蛋白在細胞內(nèi)的情況完全一致。,表達水平高與其它真核表達系統(tǒng)相比較，此系統(tǒng)最突出的特點就是能獲得重組蛋白高水平的表達，最高可使目的蛋白的量達到細胞總蛋白的50。能容納大分子的插入片段桿狀病毒粒子可以擴大，并能包裝大的基因片段，但目前尚不知桿狀病毒所能容納的外源基因長度的上限。能同時表達多個基因桿狀病毒表達系統(tǒng)具有在同一細胞內(nèi)同時表達多個基因的能力。既可采用不同的重組病毒同時感染細胞的形式，也可在同一轉(zhuǎn)移載體上同時克隆兩個外源基因，表達產(chǎn)物可加工形成具有活性的異源二聚體或多聚體。對脊椎動物安全,3）昆蟲桿狀病毒的一般概念,（1）昆蟲桿狀病毒是已知昆蟲病毒中的最大類群，是研究最多、實用意義最大的昆蟲病毒。它們是很多昆蟲病的病原，如家蠶的膿病，同時也是農(nóng)林主要害蟲的控制因子，對它的研究具有重要的意義，目前對桿狀病毒的研究日益廣泛和深入。,（2）桿狀病毒的分類桿狀病毒因其病毒粒子呈桿狀而得名。桿狀病毒科（BACULOVIRIDAE）分為①包含體桿狀病毒亞科EUBACULOVERINAE,又稱真桿狀病毒亞科；②非包含體桿狀病毒亞科NUDIBACULOVERINAE。包含體桿狀病毒亞科根據(jù)其包含體的多少和形態(tài)分為核型多角體病毒屬（NUCLEARPOLYHEDROSISVIRUS，NPV）和顆粒病毒屬（GRANULOSISVIRUS，GV）,NPV屬按囊膜內(nèi)核衣殼數(shù)目的多少分成1）單粒包埋核型多角體病毒（SNPV）代表種家蠶核型多角體病毒（BMNPV）2）多粒包埋核型多角體病毒（MNPV）代表種苜蓿尺蠖核型多角體病毒（ACMNPV）自從1983年SUMMERS等人構(gòu)建了第一個ACMNPV重組病毒表達外源基因以來，桿狀病毒表達系統(tǒng)的分子生物學(xué)及應(yīng)用研究取得了飛速發(fā)展。,（3）桿狀病毒的基因結(jié)構(gòu)以ACMNPV為例桿狀病毒基因組是共價閉合環(huán)狀的DSDNA，其基因組全長134KB，共有337個開放閱讀框，其中可以編碼多肽的區(qū)段共有137個。生理條件下，DNA與富含ARG的堿性蛋白結(jié)合，此DNA－蛋白復(fù)合體由39KD的衣殼蛋白組成的外被所包圍，形成一個核殼體。若干個核殼體外面在包被一層脂蛋白外被就成為病毒顆粒。幾個病毒顆粒聚集成一簇，嵌在晶狀基質(zhì)中成為一個多角體包含體。,（4）桿狀病毒表達載體昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)通常由轉(zhuǎn)移載體、親本病毒和重組介質(zhì)三部分組成。其技術(shù)路線分以下幾步（A）將外源片段克隆到載體質(zhì)粒中，置于桿狀病毒啟動子控制之下，上下游各有一段與親本病毒DNA相匹配的側(cè)翼序列，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體；（B）把轉(zhuǎn)移載體和野生型病毒共轉(zhuǎn)染入昆蟲細胞，通過同源重組將外源片段插入到病毒基因組，以特定的篩選標記和方法獲得重組病毒。（C）當重組病毒在受體細胞內(nèi)復(fù)制時，外源片段也得到了表達。最后空斑純化重組病毒，擴大培養(yǎng)，分離、純化所表達的外源蛋白。,轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建由于ACMNPV基因組的巨大，不可能用單一的限制性酶切位點來對它進行操作，所以目前使用的桿狀病毒表達載體系統(tǒng)大多采用構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體（TRANSFERVECTOR）。將病毒非必需基因POLH基因克隆到一個大腸桿菌質(zhì)粒中，利用限制性內(nèi)切酶和DNA外切酶或者PCR的方法，除去部分或全部POLH基因編碼序列，保留完整的啟動子部分和多角體基因下游序列，即多角體基因側(cè)翼序列，之間加入單一或者多克隆位點，可以插入外源基因。,桿狀病毒分子量大，不能象質(zhì)粒載體一樣利用多克隆位點進行基因重組，而只能利用桿狀病毒和帶有目的基因序列的質(zhì)粒載體進行共轉(zhuǎn)染。以野生型桿狀病毒ＤＮＡＡＣＭＮＰＶ進行共轉(zhuǎn)染時重組率極低,僅有01,,利用線形化的病毒載體可將重組率提高到30。在部分載體中引入了Β半乳糖苷酶基因后可以利用插入失活結(jié)合藍白斑進行重組體的篩選。BACULOGOLDTM是一種缺失衣殼蛋白編碼序列ＯＲＦ1629部分序列的缺失致死型突變體,此ＤＮＡ與基于多角體蛋白位點的轉(zhuǎn)移載體對細胞進行共轉(zhuǎn)染時,只有發(fā)生同源重組的病毒才有復(fù)制能力,果蠅表達系統(tǒng)DROSOPHILAEXPRESSIONSYSTEM，DES包含表達載體和相應(yīng)的選擇載體。通過表達載體和選擇載體的共轉(zhuǎn)染,可在3～4周時間內(nèi)獲得表達重組蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系而且通過優(yōu)化表達載體和選擇載體的比例,可以得到含有高拷貝數(shù)目的基因的細胞系,從而提高目的蛋白的表達量。,以前人們認為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆蟲細胞中復(fù)制，不能在其他昆蟲細胞如果蠅細胞中復(fù)制，然而研究表明在一定條件下，桿狀病毒也能感染果蠅細胞。在果蠅細胞中，桿狀病毒的多角體基因啟動子幾乎不發(fā)生作用，利用的是果蠅啟動子如HSP70啟動子、肌動蛋白5C啟動子、金屬硫蛋白基因啟動子等，其中，HSP70啟動子的作用最強。重組桿狀病毒感染果蠅細胞后不會引起宿主細胞的裂解，且蛋白表達水平與鱗翅目細胞相似，因此，桿狀病毒果蠅系統(tǒng)是一個很有應(yīng)用前景的昆蟲細胞表達系統(tǒng)。,4）昆蟲細胞培養(yǎng)和重組蛋白表達,（1）昆蟲細胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件所有的昆蟲細胞培養(yǎng)基都含有基本鹽類，糖類，氨基酸，有機酸，維生素以及微量元素。通常用的商品培養(yǎng)基有GRACE培養(yǎng)基，呈粉狀。配制培養(yǎng)基的時候要加入10％胎牛血清（FBS）和酵母水解物（YL）和水解乳蛋白（LH）昆蟲細胞一般在27℃生長最佳，培養(yǎng)基PH是62，無需CO2。多數(shù)昆蟲細胞的倍增時間是18－22H,,（2）昆蟲細胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞比較容易在實驗室小規(guī)模水平上（100－1000ML），在磁力攪拌瓶中生長，其密度一般可以達到3106/ML，活力在95％以上。氧的供給在成批培養(yǎng)的密閉容器中需解決通氧，而且在培養(yǎng)感染重組病毒的昆蟲細胞時耗氧量比未感染的要高。細胞保護由于昆蟲細胞對于剪切力和產(chǎn)生氣泡的敏感性，細胞容易破裂，化合物PLURONICF－68可以保護細胞因上述原因造成的損傷。其它因素還有好多因素要考慮，如反應(yīng)器的設(shè)計，細胞密度，培養(yǎng)基成分，病毒感染的條件等。,,（3）病毒感染和基因表達由于昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白是一種間歇性的程序進行生產(chǎn)的，因為所有細胞都會因病毒感染而引起病理性死亡，因此，在生產(chǎn)時往往需要至少有兩個反應(yīng)器第一個反應(yīng)器培養(yǎng)正常的昆蟲細胞，第二個反應(yīng)器用于病毒接種感染表達。,利用桿狀病毒的極早期基因IE基因啟動子構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體，由于病毒極早期基因啟動子的轉(zhuǎn)錄可以直接利用宿主細胞的RNAPOLYMERASEII，所以用這樣的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化昆蟲細胞，使昆蟲細胞能夠持續(xù)表達外源蛋白。,5）桿狀病毒表達載體系統(tǒng)的新應(yīng)用,（1）廣泛用于在昆蟲細胞中表達各種重組蛋白。昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)于20世紀80年代初期問世以來，在20多年的時間里已成為生產(chǎn)與研究各種原核、真核蛋白有力而普及的工具。,（2）用于桿狀病毒表面的蛋白展示，建立蛋白庫，簡化單克隆抗體的純化和蛋白與受體相互作用的研究。有潛力的應(yīng)用是病毒表面的蛋白展示功能（PROTEINDISPLAY）。將外源基因插入到桿狀病毒表面糖蛋白GP67的信號肽與成熟蛋白編碼序列之間，不破壞它本身的轉(zhuǎn)運及膜融合功能，從而作為載體將外源蛋白展示在病毒粒子表面。,（3）構(gòu)建含有哺乳動物啟動子的重組桿狀病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細胞，作為良好的基因轉(zhuǎn)移載體，用于基因轉(zhuǎn)移和基因治療。桿狀病毒可以被非宿主細胞如哺乳動物細胞所吞飲，但是不能在非宿主細胞中復(fù)制。帶有哺乳動物啟動子的重組桿狀病毒可以轉(zhuǎn)導(dǎo)原代培養(yǎng)的肝細胞，并表達報告基因。根據(jù)桿狀

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簡介：PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）,POLYMERASECHAINREACTIONANIMPORTANTTECHNIQUEBASEDONDNAPOLYMERASE,THEPOLYMERASECHAINREACTIONPCRISTOUSEDTOAMPLIFYASEQUENCEOFDNAINVITRO,USINGAPAIROFPRIMERSEACHCOMPLEMENTARYTOONEENDOFTHETHEDNATARGETSEQUENCE,理論,,技術(shù),DENATURATION變性THETARGETDNATEMPLATEISSEPARATEDINTOTWOSTANDSBYHEATINGTO95℃PRIMERANNEALING退火THETEMPERATUREISREDUCEDTOAROUND55℃TOALLOWTHEPRIMERSTOANNEALPOLYMERIZATIONELONGATION,EXTENSION延伸THETEMPERATUREISINCREASEDTO72℃FOROPTIMALPOLYMERIZATIONSTEPWHICHUSESDNTPSANDREQUIRESMG,THEPRINCIPLEOFPCRTHREEDIFFERENTSTEPSPROCEEDINEACHPCRCYCLE,,,,EXTENSIONDNAPOLYMERASE,,INITIALDNA,8,4,2,1,NUMBEROFDNAMOLECULES2N指數(shù)擴增,MANYCYCLES2535INCOMMONAREPERFORMEDTOCOMPLETEONEPCRREACTION,WHICHRESULTEDINANEXPONENTIALAMPLIFICATIONOFTHETARGETDNAINWHICHBOTHFORWARDANDREVERSEPRIMERSPAIR,DNATEMPLATE模板,ANYSOURCEOFDNATHATPROVIDESONEORMORETARGETMOLECULESCANINPRINCIPLEBEUSEDASATEMPLATEFORPCRWHATEVERTHESOURCEOFTEMPLATEDNA,PCRCANONLYBEAPPLIEDIFSOMESEQUENCEINFORMATIONISKNOWNSOTHATPRIMERSCANBEDESIGNED,FIGURE83SUBSTRATESREQUIREDFORDNASYNTHESIS,PCRPRIMERS,ANNEALONOPPOSITESTRANDSOFTHETARGETSEQUENCEFORWARDANDREVERSEPRIMERS（正向引物和反向引物）HAVESIMILARGCCONTENTSTMSOTHATTHEYANNEALTOTHEIRCOMPLEMENTARYSEQUENCESATSIMILARTEMPERATURESANNEALTEMPERATURETM5°C,5’ATTCCGATCGCTAATCGATGGCTCCTGTGCATTTCGCCACTAGAG3’3’TAAGGCTAGCGATTAGCTACCGAGGACACGTAAAGCGGTGATCTC5’,5’ATTCCGATCGCTAATCGATG3’,3’CACGTAAAGCGGTGATCTC5’,FORWARDPRIMER,REVERSEPRIMER,,,,5’CTCTAGTGGCGAAATGCAC3’,,,,EXTENSIONDNAPOLYMERASE,PCRENZYMES,DENATURATION變性THETARGETDNATEMPLATEISSEPARATEDINTOTWOSTANDSBYHEATINGTO95℃PRIMERANNEALING退火THETEMPERATUREISREDUCEDTOAROUND55℃TOALLOWTHEPRIMERSTOANNEALPOLYMERIZATIONELONGATION,EXTENSION延伸THETEMPERATUREISINCREASEDTO72℃FOROPTIMALPOLYMERIZATIONSTEPWHICHUSESDNTPSANDREQUIRESMG2,TAQPOLYMERASEISOLATEDFROMTHETHERMOPHILICBACTERIUMTHERMUSAQUATICUS嗜熱菌）,耐熱DNA聚合酶，耐高溫ITHASNO3’TO5’PROOFREADINGEXONUCLEASEACTIVITYHIGHACCURACYDNAPOLYMERASEISAVAILABLECOMMERCIALLY高保真酶）,PCR儀,DISCOVERYOFPCRTECHNIQUE,希望大家不僅僅知道“是什么”，而且也了解“為什么”和“結(jié)論是怎么得出來的”,如果你的研究能力一般，那么，改革本研究領(lǐng)域中大家習(xí)以為常的最基本的技術(shù)，你就有可能獲諾貝爾獎KARYMULLIS卡里穆利斯,THEREPLICATIONOFDNA,哥倫布豎立雞蛋的故事DNA分子的拷貝術(shù)，復(fù)印機,PCR技術(shù)的發(fā)現(xiàn)充滿傳奇色彩KARYMULLIS卡里穆利斯1972年獲得加州大學(xué)伯克利分校生物化學(xué)博士學(xué)位1979年進入塞特斯公司與DNA合成相關(guān)的工作1983年4月PCR的最初想法高速公路的靈感23010億想法付諸行動1983年12月第一個PCR反應(yīng)成功1984年塞特斯公司申請PCR技術(shù)專利,PCR技術(shù)引來的官司誰發(fā)明了PCRDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)者紙上談兵KARYMULLIS卡里穆利斯勝訴,KARYMULLISWONTHE1993NOBELPRIZEINCHEMISTRYFORHISINVENTIONOFTHEPOLYMERASECHAINREACTION,心靈的裸舞自傳,MYPRESENTRESEARCHWORKDEGENERATEPCRCANBEUSEDTOCLONEGENECODINGFORENZYME簡并引物PCR結(jié)合自己的研究工作,PCRAPPLICATIONEXAMPLE1,CODONDEGENERATEANTICODONWOBBLE,密碼子的簡并性,MANYAMINOACIDSARESPECIFIEDBYMORETHANONECODONDEGENERACY簡并性CODONSSPECIFYINGTHESAMEAMINOACIDARECALLEDSYNONYMS同義密碼子,G,DEGENERATEPRIMERS簡并引物ANOLIGOPOOLDERIVEDFROMAPROTEINSEQUENCEHISPHEPROPHEMETLYSCANGENERATEAPRIMER5’CAYTTYCCNTTYATGAAR3’YPYRIMIDINECORTNANYBASERPURINEAORG,DEGENERATEPCR簡并PCR,MYRESEARCHWORKMOLECULARBIOLOGYRESEARCHOFLACCASE漆酶PRODUCEDINFUNGI白腐真菌漆酶的分子生物學(xué)研究,白腐真菌,白腐真菌（WHITEROTFUNGI,白腐真菌是一類使木材呈白色腐朽的絲狀真菌的總稱（主要是擔(dān)子菌）已知的唯一能在純系培養(yǎng)中有效地將木質(zhì)素徹底降解為CO2和H2O的一類微生物,,,,對與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)相似的異生物質(zhì)污染物也具有強大的降解能力,木質(zhì)素過氧化物酶（LIP）錳過氧化物酶（MNP）漆酶（LAC）,白腐真菌木質(zhì)素降解酶系,非立體選擇性和非特異性,漆酶（LACCASE）,含銅的多酚氧化酶,白腐真菌降解木質(zhì)素的重要酶具有廣泛的底物作用范圍和獨特的生物降解功能環(huán)境生物技術(shù),BIOTECHNOLOGYADVANCES242006500–513,USEDEGENERATEPCR簡并PCRTOCLONELACCASEGENE,COPPERBINDINGREGIONISHIGHLYCONSERVED,COPPERBINDINGREGIONIHISTRPHISGLYPHEPHEGLN,COPPERBINDINGREGIONIVHISCYSHISILEASPPHEHIS,簡并引物PCR獲得16KB漆酶基因特異性序列,,基因組步移技術(shù)獲得2118BP漆酶全長結(jié)構(gòu)基因,,RACE和RTPCR克隆得到了1566BP漆酶基因全長CDNA序列,我們自己的研究工作,QUESTION,BYDEGENERATEPCR,ONLYTHEPARTIALSEQUENCEOFONEGENECANBEOBTAINED,HOWCANWEGETTHEENTIREGENE,,CHROMOSOMEWALKING染色體步移技術(shù),LONGDISTANCEINVERSEPCRTECHNIQUEFOREFFICIENTCLONINGOFFLANKINGSEQUENCESADJACENTTOKNOWNDNAFRAGMENTS,INVERSEPCR反向PCR,REVERSETRANSCRIPTASERTPCR逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測基因的轉(zhuǎn)錄量,PCRAPPLICATIONEXAMPLE2,,REVERSETRANSCRIPTASERTPCR逆轉(zhuǎn)錄PCR,,,,AAAAN,5‘CAP,MRNA,,DT1218PRIMER,ANNEAL,,,,5‘CAP,AAAAN,,3‘,5‘,,REVERSETRANSCRIPTION,DNTP,RT,,,,5‘CAP,,AAAAN,,5‘,,CDNAMRNAHYBRID,,REGULARPCR,RTPCRAPPLICATION,CLONECDNAOFSPECIFICGENEDETECTINGTHEEXPRESSIONLEVELOFGENE,STUDYTHISTECHNIQUEFROMEXPERIMENT實戰(zhàn)中學(xué)習(xí),DETECTINGTHEEXPRESSIONLEVELOFGENEBYRTPCR,MRNA,,CDNA,,RTPCRPRODUCT,RIGHTPANELPCRAMPLIFICATIONOFTHECLONEDLAC1CDNAUSINGTHECYCLENUMBEROBTAINEDFROMTHELEFTPANEL,VALIDATIONOFSEMIQUANTITATIVERTPCRASSAYSFOREXPRESSIONLEVELOFLAC1LACCASEGENE,LEFTPANELKINETICSOFPCRAMPLIFICATIONWITHTHEELECTROPHORETICIMAGESHOWNATTHETOPTHECYCLENUMBER28THATGENERATESHALFMAXIMALREACTIONWASUSEDTOANALYSETHEEXPRESSIONOFTHEGENE,EURJBIOCHEM2004271,318–328,RTPCRANALYSISOFTRANSCRIPTIONOFLAC1INDUCEDBYDIFFERENTCONCENTRATIONSOFCOPPER,LAC1LACCASEGENEGPDHOUSEKEEPINGGENE,THEEXPRESSIONLEVELSWERENORMALIZEDBYUSINGTHERELATIVEMRNARATIOLAC1/GPDSEMIQUANTITATIVERTPCR,各種芳香化合物對LACCASE基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控效果是不同的,EURJBIOCHEM2004271,318–328,,RTPCR反轉(zhuǎn)錄PCR）EFFECTSOFVARIOUSCOPPERCONCENTRATIONSONLCCMRNA,,MEASURETHELACCASEACTIVITYEFFECTSOFVARIOUSCOPPERCONCENTRATIONSONLACCASEACTIVITY,

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簡介：MOLECULARGENETICSANDGENOMICSFALLSEMESTER,2010主講教師薛樹林聯(lián)系電話84396024地址金陵研究院316EMAILXSLNJAUEDUCN植物應(yīng)用基因組學(xué)與生物信息中心,1出勤及回答問題情況30（隨機提問形式）2期末考試70（閉卷）,考核方式,,對于選修基因組學(xué)課程的同學(xué)，采取寫一篇課程論文的考核方式（70）。2學(xué)分，周五35節(jié)，教學(xué)樓B301,REFERENCES,GENOMES2,GENOMES3BYBROWNTAGENEVIII,GENEIXBYBLEWINJOURNALSONPLANTMOLECULARGENETICS現(xiàn)代分子生物學(xué)，朱玉賢，李毅著基因組學(xué)楊金水著分子克隆實驗指南（第3版），薩姆布魯克（美）主編,,CHAPTER1GENOMES,TRANSCRIPTOMESANDPROTEOMESCHAPTER2STUDYINGDNACHAPTER3MAPPINGGENOMESCHAPTER4SEQUENCINGANDANNOTATIONOFGENOMESCHAPTER5EUKARYOTICNUCLEARGENOMESCHAPTER6GENOMESOFPROKARYOTESANDEUKARYOTICORGANELLESCHAPTER7GENOMEEXPRESSIONCHAPTER8GENOMEEVOLUTION,OUTLINEOFTHISCOURSE,,CHAPTER1GENOMES,TRANSCRIPTOMESANDPROTEOMES,基因組（GENOME）由德國漢堡大學(xué)威克勒教授于1920年首創(chuàng)，指生物的整套染色體所含有的全部DNA或RNA序列?；蚪M是地球上每一物種具有的生物學(xué)信息的存儲庫?；蚪M學(xué)（GENOMICS）由羅德里克于1986年首創(chuàng)，指研究生物的整個基因組，涉及基因組作圖、測序和功能分析的一門學(xué)科。,1概述,基因組所包含的生物信息的利用需要酶及其他參與基因組表達過程中一系列復(fù)雜生化反應(yīng)的蛋白質(zhì)的協(xié)同活性。基因組表達的最初產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄組，即那些含有細胞在特定時間所需生物信息、編碼蛋白質(zhì)的基因衍生而來的RNA分子的集合。轉(zhuǎn)錄組由轉(zhuǎn)錄過程來維持?；蚪M表達的第二個產(chǎn)物是蛋白質(zhì)組，即細胞中那些決定細胞能夠進行生化反應(yīng)的所有蛋白質(zhì)組分。這是通過翻譯過程來完成的。,細胞的蛋白質(zhì)庫,DNA由JOHANNFRIEDRICHMIESCHER在1869年發(fā)現(xiàn),這位瑞士生物學(xué)家當時在德國蒂賓根（TUBINGEN）工作。,2DNA,21GENESAREMADEOFDNA,奧地利神父孟德爾1865年根據(jù)7個碗豆性狀的實驗提出了遺傳因子假說，認為每個性狀由遺傳因子控制，并提出了遺傳因子的分離與自由組合兩大遺傳規(guī)律。,證明基因由核酸DNA或RNA組成的3個著名實驗①肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化試驗；②噬菌體感染實驗；③煙草花葉病毒的感染實驗。,A1928年，荷蘭細菌學(xué)家格里菲斯（GRIFFITH）的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗GRIFFITH在研究肺炎球菌時發(fā)現(xiàn)肺炎球菌有很多不同菌株，其中有一種菌株它的球菌有毒性，能引起小鼠得敗血病。這些有毒的球菌外面有保護作用的多糖膠狀莢膜，使它們可以不被宿主的正常保護機構(gòu)所破壞；當它們生長在培養(yǎng)基上時，每一個細菌長成一個明亮的光滑菌落，叫光滑型（S）菌株；另外一些菌株無莢膜，菌落粗糙，沒有毒性，不會引起疾病，叫R型菌株。,1,2,3,4,這表明無毒性的R型活細菌在與被加熱殺死的S型細菌混合后，轉(zhuǎn)化成了有毒性的S型活細菌。這些轉(zhuǎn)化成的S型細菌的后代也是有毒性的S型細菌，可見這種性狀的轉(zhuǎn)化是可以遺傳的。1944年，艾弗里從S型活細菌中提取了DNA，蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)，然后分別加入到培養(yǎng)R型細菌的培養(yǎng)基中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有加入DNA時，R型細菌才能轉(zhuǎn)化成S型細菌。通過上述研究表明，DNA是使R型細菌產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的物質(zhì)，所以DNA是遺傳物質(zhì)。,B噬菌體感染實驗噬菌體T2有一個蛋白質(zhì)的外殼，DNA裹在其中。當噬菌體T2感染大腸桿菌時，它的尾部吸附在菌體上。然后，菌體內(nèi)形成大量噬菌體，菌體裂解后，釋放出幾十個乃至幾百個與原來感染細菌一樣的噬菌體T2。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸中，甲硫氨酸和半胱氨酸含有硫，DNA中不含S，所以S只存在于T2噬菌體的蛋白質(zhì)。相反，P主要存在于DNA中，至少占T2噬菌體含磷量的99％。ALFEDHERSHEY和MARTHACHASE1952將宿主菌細胞分別放在含35S或含32P的培養(yǎng)基中。宿主細胞在生長過程中就被35S或32P標記上了。然后用噬菌體去感染分別被S或P標記的細菌，并在這些細菌中復(fù)制增殖。宿主菌裂解釋放出很多子代噬菌體，這些子代噬菌體也被標記上35S或32P。,接著，用分別被35S或32P標記的噬菌體去感染沒有被放射性同位素標記的宿主菌，然后測定宿主菌細胞帶有的同位素。被35S標記的噬菌體所感染的宿主菌細胞內(nèi)很少有35S，而大多數(shù)35S出現(xiàn)在宿主菌細胞的外面。也就是說，35S標記的噬菌體蛋白質(zhì)外殼在感染宿主菌細胞后，并未進入宿主菌細胞內(nèi)部而是留在細胞外面。被32P標記的噬菌體感染宿主菌細胞后，測定宿主菌的同位素，發(fā)現(xiàn)32P主要集中在宿主菌細胞內(nèi)。所以噬菌體感染宿主菌細胞時進入細胞內(nèi)的主要是DNA。由此可以得出結(jié)論噬菌體注入宿主菌細胞內(nèi)的物質(zhì)是DNA，釋放出來的是跟原先感染細菌細胞一樣的噬菌體?？梢娫谑删w的生活史中，只有DNA是聯(lián)系親代和子代的物質(zhì)。,C煙草花葉病毒的感染實驗對病毒的研究逐漸深入以后，發(fā)現(xiàn)一些植物的病毒僅含有RNA沒有DNA。當用煙草花葉病毒（TMV）的RNA和蛋白質(zhì)分別進行感染試驗，發(fā)現(xiàn)只有RNA才能誘發(fā)感染。RNA也是遺傳物質(zhì),RNA,,蛋白質(zhì),22THESTRUCTUREOFDNA,核苷酸,ANUCLEOTIDESANDPOLYNUCLEOTIDES,2’脫氧核糖,多聚核苷酸,3’,5’磷酸二酯鍵,DNA多聚核苷酸合成的聚合反應(yīng),22THESTRUCTUREOFDNA,BTHEMODELOFDOUBLEHELIX,DNA晶體X射線衍射圖譜為揭示DNA分子的二級結(jié)構(gòu)提供了重要實驗證據(jù),AWATSONANDCRICK1953提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型DNA分子通常以右手雙螺旋形式存在，兩條核苷酸鏈反向平行，且互為互補鏈。戊糖－磷酸骨架在分子的外鍘，在分子表面形成大溝和小溝，堿基堆積于螺旋內(nèi)部堿基間通過氫鍵相互連接，A和T以2個氫鍵配對，G和C以3個氫鍵配對螺旋中相鄰堿基間相隔034NM，每10個堿基對螺旋上升一圈，螺距為34NM，直徑為237NM。,WIDTH237NM,34NM,4,3,1,4,2,5,6,盡管氫鍵使得雙鏈中的堿基間的配對具有特異性（只有互補的兩條鏈之間才能形成DNA雙鏈），但其對于雙螺旋的總體上的穩(wěn)定性并無太大貢獻。核酸分子的穩(wěn)定性的根源在于堿基對之間的疏水堆積力。作為芳香族化合物，堿基的平面使其不能在自由溶液中與水分子形成氫鍵，即它們是疏水的。疏水效應(yīng)使雙鏈DNA成為能量上最為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。盡管這種堆積作用在RNA中也存在，但其在雙鏈DNA中達到了最大化。,BDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定力堿基間形成的氫鍵相鄰堿基間的疏水堆積力堿基相互作用的范德華力,CDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的類型三種形態(tài)的DNAADNA,BDNA,ZDNA兩類右手螺旋和左手螺旋,A,B,Z,DNA雙螺旋不同構(gòu)象的特征,螺旋直徑,螺距,3RNAANDTHETRANSCRIPTOME,基因組表達的最初產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄組，即那些含有細胞在特定時間所需生物信息、編碼蛋白質(zhì)的基因衍生而來的RNA分子的集合。轉(zhuǎn)錄組中的RNA分子以及其他來自非編碼基因的RNA都由轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生。,31THESTRUCTUREOFRNA,,核糖,,A,C,G,U,穩(wěn)定性差主要以單鏈形式存在,依賴模板的RNA合成,DNADEPENDENTRNAPOLYMERASES,32細胞內(nèi)的RNA組分,一個典型的細菌細胞含有005–010PG的RNA，約占其總質(zhì)量的6。一個哺乳動物細胞，比細菌大得多，含有20–30PGRNA，但是只占細胞總質(zhì)量的1。,細胞內(nèi)的RNA組分,核小RNA,核仁小RNA,微小RNA,短干擾RNA,所有生物,僅真核生物,核小RNASNRNA發(fā)現(xiàn)于真核生物細胞核中，與前體MRNA剪接成成熟MRNA的過程相關(guān)。核仁小RNA（SNORNA）發(fā)現(xiàn)于真核細胞核的核仁區(qū)，在RRNA分子的加工過程中起到核心作用（比如在某個核苷酸位點上加上一個甲基）。微小RNA（MIRNA）和短干擾RNA（SIRNA）是調(diào)控個別基因表達的小RNA。,33PROCESSINGOFPRECURSORRNA,末端修飾,剪接,剪切,化學(xué)修飾,PRERRNAPRETRNA,RNAEDITING,新的化學(xué)基團,34THETRANSCRIPTOME,轉(zhuǎn)錄組雖然不到細胞總RNA的4，卻是細胞中最重要的組分，因為它包含了基因組表達的下一個階段中所要使用的編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組從不從頭合成（DENOVO），一個細胞通過細胞分裂誕生時就接收了其上一代的部分轉(zhuǎn)錄組，并維持一生。各蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄過程并不是導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組的合成，而是通過替換被降解的MRNA來維持轉(zhuǎn)錄組，并通過開閉不同的基因的表達來改變轉(zhuǎn)錄組的組成。,35轉(zhuǎn)錄組研究的方法,A通過序列分析研究轉(zhuǎn)錄組,研究轉(zhuǎn)錄組最直接的方法是將其中的MRNA轉(zhuǎn)變?yōu)镃DNA，并對所有CDNA克隆進行測序，再與基因組序列進行比較分析。還可以借助第二、三代測序技術(shù)直接對RNA進行測序。,35轉(zhuǎn)錄組研究的方法,A通過序列分析研究轉(zhuǎn)錄組,基因表達系列分析（SERIALANALYSISOFGENEEXPRESION,SAGE）,SAGE技術(shù)不是研究完整的CDNA，它產(chǎn)生長度12BP的短序列，每一條都代表了轉(zhuǎn)錄組中存在的一種MRNA。,技術(shù)基礎(chǔ)41216,777,216BP，真核MRNA平均1500BP，412相當于11,000個轉(zhuǎn)錄物，這比最復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組中存在轉(zhuǎn)錄物數(shù)目還多，因此12BP序列能夠代表某一種MRNA。,BSMF1是一種不常見的限制性內(nèi)切酶，它不在其識別序列內(nèi)部，而是在識別位點下游1014個NT處切割。,SAGE,纖維素微粒,4BP,頻繁切割,洗脫去除,連接一個含有BSMF1識別序列的寡聚核苷酸,切下來的片段被收集起來，頭尾相連以產(chǎn)生一個串聯(lián)體，進行測序分析。串聯(lián)體中的各個標簽序列信息被讀取并與基因組中的基因序列比對，從而可以分析哪些基因被轉(zhuǎn)錄，表達水平如何。,SAGE,35轉(zhuǎn)錄組研究的方法,B通過微陣列或芯片分析來研究轉(zhuǎn)錄組,,探針,原位合成并固化的寡聚核苷酸PCR產(chǎn)物CDNA,,優(yōu)點可用于快速評估兩個或多個轉(zhuǎn)錄組間的差異。,109拷貝，過量,構(gòu)成轉(zhuǎn)錄組的MRNA總體被反轉(zhuǎn)錄成一個CDNA的混合物，然后被標記，用于和芯片或微陣列雜交。,35轉(zhuǎn)錄組研究的方法,B通過微陣列或芯片分析來研究轉(zhuǎn)錄組,與基因中不同位置匹配的寡聚核苷酸鏈（包含20種左右）,探針標記效率雜交效率,玻璃片，尼龍膜,玻璃片，硅片,用不同的熒光來標記CDNA樣品，微陣列與兩個樣品同時雜交，可以減少由于試驗誤差引起的差異。,4PROTEINSANDTHEPROTEOME,基因組表達的第二個產(chǎn)物是蛋白質(zhì)組，即細胞中那些決定細胞能夠進行生化反應(yīng)的所有蛋白質(zhì)組分。這些蛋白質(zhì)是通過翻譯那些組成轉(zhuǎn)錄組的MRNA分子而合成的。,MOLCELLPROTEOMICS88PROTEOMICS44,41PROTEINSTRUCTURE,蛋白質(zhì)和DNA分子一樣，是一個線性的無分支的多聚體。蛋白質(zhì)中的單體亞單位稱為氨基酸。氨基酸形成的多聚體或多肽在長度上很少超過2000個單位。,氨基酸的一般結(jié)構(gòu),ATHEFOURLEVELSOFPROTEINSTRUCTURE,41PROTEINSTRUCTURE,APRIMARYSTRUCTURE,ATHEFOURLEVELSOFPROTEINSTRUCTURE,41PROTEINSTRUCTURE,BSECONDARYSTRUCTURE,指多肽采取的不同構(gòu)象，由不同氨基酸之間形成的氫鍵所穩(wěn)定。?螺旋；?片層,ATHEFOURLEVELSOFPROTEINSTRUCTURE,41PROTEINSTRUCTURE,BTERTIARYSTRUCTURE,是將多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)組分折疊成為三維構(gòu)型而形成的。,它被各種化學(xué)力所穩(wěn)定,ATHEFOURLEVELSOFPROTEINSTRUCTURE,41PROTEINSTRUCTURE,DQUATERNARYSTRUCTURE,兩條或更多已形成三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈組合在一起形成一個多亞基蛋白質(zhì)。,不是所有蛋白質(zhì)都有四級結(jié)構(gòu)；穩(wěn)定力包括二硫鍵（穩(wěn)定）；氫鍵，疏水作用（松散）,NATURE,27NOV,2008,B蛋白質(zhì)的多樣性取決于氨基酸的多樣性,41PROTEINSTRUCTURE,組成蛋白質(zhì)的氨基酸在化學(xué)性質(zhì)上有多樣性，因此蛋白質(zhì)的功能也是多種多樣的。氨基酸的多樣性源于R基團。,氨基酸的R基團,非極性（疏水）,極性（親水）,帶負電荷,P19,帶正電荷,42THEPROTEOME,蛋白質(zhì)組包括了在特定時間存在于細胞中的所有蛋白質(zhì)。一個典型的哺乳動物細胞，如肝細胞中，含有10000～20000種不同的蛋白質(zhì)，共有約8X109個蛋白質(zhì)分子，重約05NG，占細胞總重量的1820。各種蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)差別很大，最少的每個細胞中不足20000個，最多的可達1億個。每個細胞中拷貝數(shù)大于50000的蛋白質(zhì)被認為含量較豐富，通常哺乳動物細胞中約有2000種蛋白質(zhì)屬于此類，它們大多屬于管家蛋白。,42THEPROTEOME,ATHELINKBETWEENTHETRANSCRIPTOMEANDTHEPROTEOME,GENETICCODE,四個標點密碼子,42THEPROTEOME,BTHEGENETICCODEISNOTUNIVERSAL,42THEPROTEOME,B蛋白質(zhì)組和細胞生化功能之間的聯(lián)系,基因組編碼的生物學(xué)信息最終由蛋白質(zhì)表現(xiàn)。蛋白質(zhì)能夠執(zhí)行各種生物學(xué)功能,生物催化作用（酶）；結(jié)構(gòu)（細胞骨架由蛋白質(zhì)決定）；運動（收縮蛋白）；運輸（血紅蛋白運輸血液中的氧）；調(diào)節(jié)細胞進程（信號蛋白、活化調(diào)節(jié)因子）；保護細胞個體（抗體）；儲藏功能（麥醇溶蛋白）。,43蛋白質(zhì)組研究的方法,A蛋白譜（表達蛋白質(zhì)組學(xué)）,用來研究一個蛋白質(zhì)組組成的特定技術(shù)。,蛋白譜基于兩項技術(shù)蛋白電泳和質(zhì)譜,A雙向電泳,分子量,等電點蛋白質(zhì)的凈電荷為零時溶液的PH值。,等電聚焦,等電點,雙向凝膠電泳結(jié)果,,尋找差異表達點,BMALDITOF基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜,43蛋白質(zhì)組研究的方法,A蛋白譜,用于鑒定蛋白組中的蛋白質(zhì)，最多可以分析出50個氨基酸長度的多肽，因此一個蛋白質(zhì)可以通過胰酶將其消化后進行測定。一旦多肽片段被離子化，多肽的質(zhì)量/電荷比就可以通過它在質(zhì)譜儀中從電離源到檢測器的“飛行時間”來確定。通過質(zhì)荷比能夠確認多肽片段的分子質(zhì)量。計算機中含有一個由所研究的物種基因組編碼的每一個蛋白質(zhì)經(jīng)胰酶消化后各個片段的預(yù)計相對分子質(zhì)量的數(shù)據(jù)庫，計算機通過比較數(shù)據(jù)庫與檢測到的多肽片段的分子質(zhì)量來確認最可能的初始蛋白質(zhì)。,質(zhì)量/電荷比,多肽通過來自激光的脈沖能量被電離化,柱腔,質(zhì)量/電荷比,波譜數(shù)據(jù),計算機通過比較數(shù)據(jù)庫與檢測到的多肽質(zhì)量來確認最可能的初始蛋白質(zhì)。,43蛋白質(zhì)組研究的方法,B蛋白質(zhì)印跡法（WESTERN雜交）,WESTERN雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質(zhì)的檢測方法。其原理是生物中含有一定量的目標蛋白。先從生物細胞中提取總蛋白或目標蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDSPAGE電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉其非特異性位點。,43蛋白質(zhì)組研究的方法,B蛋白質(zhì)印跡法（WESTERN雜交）,然后加入特異性抗體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結(jié)合后，再加入能與一抗專一性結(jié)合的帶標記的二抗（通常一抗用兔來源的抗體時，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體），最后通過二抗上帶標記化合物（一般為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，或用同位素或生物素標記）的特異性反應(yīng)進行檢測。根據(jù)檢測結(jié)果，從而可得知被檢生物細胞內(nèi)目的蛋白的表達與否、表達量及分子量等情況。,WESTERNBLOTTING,電泳印跡,43蛋白質(zhì)組研究的方法,C鑒定與某一蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì),通過鑒定有相互作用的成對或成組的蛋白質(zhì)能夠獲得基因組活性相關(guān)的重要數(shù)據(jù)。構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用圖譜被視為是連接蛋白質(zhì)組學(xué)與細胞生物化學(xué)過程的一個重要步驟。,43蛋白質(zhì)組研究的方法,C鑒定與某一蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì),A噬菌體展示,該技術(shù)采用了一種基于?噬菌體或某種絲狀噬菌體的獨特的克隆載體。待測基因被插入載體后，它的蛋白質(zhì)產(chǎn)物能與噬菌體外殼蛋白以融合形式表達。,噬菌體外殼蛋白基因,插入要展示的蛋白質(zhì)的DNA,制備一種展示噬菌體,融合可讀框,使用噬菌體展示庫來尋找與待測蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的噬菌體。,把待測蛋白質(zhì)固定在微量滴定盤的孔中,B酵母雙雜交,43蛋白質(zhì)組研究的方法,C鑒定與某一蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì),激活因子（轉(zhuǎn)錄因子）一類控制基因表達的蛋白質(zhì)，包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。雙雜交系統(tǒng)使用缺乏某一報告基因相應(yīng)激活因子的釀酒酵母菌株，此時報告基因是不表達的。,轉(zhuǎn)化酵母后產(chǎn)生融合蛋白,待測基因,,一系列DNA片段混合物,,使用酵母雙雜交篩選相互作用的蛋白質(zhì),兩套克隆混合，共轉(zhuǎn)化酵母,,43蛋白質(zhì)組研究的方法,D蛋白質(zhì)相互作用圖譜,也叫蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，能展現(xiàn)一個蛋白質(zhì)組中各成員間發(fā)生的相互作用。,釀酒酵母蛋白質(zhì)相互作用圖譜（2001）,數(shù)據(jù)來自酵母雙雜交試驗,釀酒酵母蛋白質(zhì)相互作用圖譜（2002）,數(shù)據(jù)來自酵母雙雜交試驗,THEGENOMETELLSYOUWHATCOULDBEHAPPENEDTHEORETICALLYINTHECELLTRANSCRIPTOMETELLSYOUWHATMIGHTBEHAPPENEDANDTHEPROTEOMETELLSYOUWHATISHAPPENING,SUMMARY,本章學(xué)習(xí)要點理解GENOMES,TRANSCRIPTOMES和PROTEOMES三個名詞，并闡明它們在基因組表達過程中是如何聯(lián)系在一起的；理解基因由DNA（或RNA）組成的三個實驗；掌握雙螺旋結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵特征；正確區(qū)分編碼RNA和功能性RNA；描述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同層次；描述遺傳密碼的關(guān)鍵特征；掌握轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的一般研究方法，特別是SAGE技術(shù)、微陣列和基因芯片技術(shù)以及鑒定蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)（噬菌體展示、酵母雙雜交等）。,

簡介：氨基酸代謝,METABOLISMOFAMINOACIDS,第七章,張曉偉XIAOWEIZHANGBJMUEDUCN,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生化與分子生物學(xué)系,第一節(jié)氨基酸代謝概況,氨基酸的來源與去路食物蛋白質(zhì)的需要量及營養(yǎng)作用蛋白質(zhì)的消化、吸收與腐敗組織蛋白質(zhì)的降解,INTRODUCTION,氨基酸代謝庫,氨基酸代謝的來源與去路,必需氨基酸ESSENTIALAMINOACID體內(nèi)需要但不能自身合成，必須由食物供給的氨基酸，包括VAL、ILE、PHE、MET、LEU、TRP、THR、LYS（攜一本淡亮色書來）。,一、食物蛋白質(zhì)的需要量及營養(yǎng)作用,,1、生理需要量（成人）分解量20G/日最低需量3050G/日推薦量我國營養(yǎng)學(xué)會80G/日,2、氮平衡（蛋白質(zhì)的平均含氮量為16）,氮的總平衡（正常成人）攝入氮排出氮,氮的負平衡饑餓/消耗性疾病攝入氮排出氮,衡量指標食物蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值高低取決于其AA的數(shù)量及蛋白組成與人體蛋白質(zhì)的接近程度和所含必需氨基酸ESSENTIALAMINOACID的種類和數(shù)量。主要取決于食物蛋白質(zhì)的“質(zhì)”,3、食物蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值,蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值是指食物蛋白質(zhì)在體內(nèi)的利用率。,食物蛋白質(zhì)的互補作用營養(yǎng)價值較低的食物蛋白質(zhì)合理搭配、混合食用，從而互補必需氨基酸的不足，提高蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的作用。〔舉例〕谷類蛋白質(zhì)賴氨酸少，色氨酸多豆類蛋白質(zhì)賴氨酸多，色氨酸少,二、蛋白質(zhì)的消化、吸收與腐敗,1、蛋白質(zhì)的消化,由大分子轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿樱阌谖障N屬特異性和抗原性，防止過敏、毒性反應(yīng),消化過程自胃中開始，在小腸中完成。,（1）胃中的消化作用,胃蛋白酶的最適PH為15～25，對蛋白質(zhì)肽鍵作用特異性差，產(chǎn)物主要為多肽及少量氨基酸。,胃蛋白酶對乳汁中的酪蛋白有凝乳作用，使之在胃停留時間長，利于充分消化，對乳兒較重要。,（2）小腸中的消化蛋白質(zhì)消化的主要部位,胰酶及其作用胰酶是消化蛋白質(zhì)的主要酶，最適PH為70左右，包括內(nèi)肽酶和外肽酶。,內(nèi)肽酶ENDOPEPTIDASE水解蛋白質(zhì)肽鏈內(nèi)部的一些肽鍵，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶。,外肽酶EXOPEPTIDASE自肽鏈的末段開始每次水解一個氨基酸殘基，如羧基肽酶A、B、氨基肽酶。,小腸粘膜細胞的消化作用主要是寡肽酶的作用，如氨基肽酶及二肽酶等。,胃蛋白酶原（MW40000）,胰蛋白酶原胰蛋白酶,糜蛋白酶原糜蛋白酶彈性蛋白酶原彈性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶（A及B）（A及B）,,,,,,,,,腸激酶ENTEROKINASE對胰酶的激活,可保護胰組織免受蛋白酶的自身消化作用。保證酶在其特定的部位和環(huán)境發(fā)揮催化作用。酶原還可視為酶的貯存形式。,腸激酶,2、氨基酸的吸收,吸收部位主要在小腸吸收形式氨基酸、寡肽、二肽吸收機制耗能的主動吸收過程,（1）氨基酸吸收的載體（CARRIERPROTEIN,載體蛋白與氨基酸、NA組成三聯(lián)體。ATP供能將氨基酸、NA轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，NA再由鈉泵排出細胞。,腸粘膜細胞氨基酸載體蛋白的作用,（2）Γ谷氨?；h(huán)ΓGLUTAMYLCYCLE/MEISTERCYCLE,谷胱甘肽對氨基酸的轉(zhuǎn)運谷胱甘肽再合成,（3）肽的吸收二肽/三肽轉(zhuǎn)運體系,利用腸粘膜細胞上的二肽或三肽的轉(zhuǎn)運體系此種轉(zhuǎn)運也是耗能的主動吸收過程吸收作用在小腸近端較強,,3、蛋白質(zhì)的腐敗PUTREFACTION,腸道細菌對蛋白質(zhì)及其消化產(chǎn)物的作用腐敗作用的產(chǎn)物大多有害，如胺、氨、苯酚、吲哚等；也可產(chǎn)生少量的脂肪酸及維生素等可被機體利用的物質(zhì)。,（1）胺類AMINES的生成,假神經(jīng)遞質(zhì)FALSENEUROTRANSMITTER,某些物質(zhì)結(jié)構(gòu)與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，可取代正常神經(jīng)遞質(zhì)從而影響腦功能，稱假神經(jīng)遞質(zhì)。,Β羥酪胺和苯乙醇胺結(jié)構(gòu)類似兒茶酚胺，它們可取代兒茶酚胺與腦細胞結(jié)合，但不能傳遞神經(jīng)沖動，使大腦發(fā)生異常抑制。,（2）氨的生成氨基酸脫氨、尿素分解,降低腸道PH，NH3轉(zhuǎn)變?yōu)镹H4以氨鹽形式排出，可減少氨的吸收，這是酸性灌腸的依據(jù)。,（3）其他有害物質(zhì)的生成苯酚、吲哚、甲基吲哚、硫化氫,,12/總蛋白質(zhì)/天被降解DEGRADATION,人血漿蛋白質(zhì)T1/210天肝蛋白質(zhì)T1/218天結(jié)締組織T1/2180天,蛋白質(zhì)的半壽期HALFLIFE蛋白質(zhì)降低其原濃度一半所需要的時間，用T1/2表示,三、組織蛋白質(zhì)的降解,真核生物中蛋白質(zhì)的降解有兩條途徑,不依賴ATP利用組織蛋白酶CATHEPSIN降解外源性蛋白、膜蛋白和長壽命的細胞內(nèi)蛋白,②依賴泛素UBIQUITIN的降解過程,①溶酶體內(nèi)降解過程,依賴ATP降解異常蛋白和短壽命蛋白,泛素,76個氨基酸的小分子蛋白85KD普遍存在于真核生物而得名一級結(jié)構(gòu)高度保守,1泛素化UBIQUITINATION,泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程,泛素選擇性與降解蛋白質(zhì)形成共價連接，使其激活,2蛋白酶體PROTEASOME對泛素化蛋白質(zhì)的降解,泛素化過程,E1泛素活化酶,E2泛素攜帶蛋白,E3泛素蛋白連接酶,如基因表達、細胞增殖、炎癥反應(yīng)、誘發(fā)癌瘤（促進抑癌蛋白P53降解）,體內(nèi)蛋白質(zhì)降解參與多種生理、病理調(diào)節(jié)過程,氨基酸代謝庫METABOLICPOOL,體內(nèi)所有游離氨基酸的總稱。即食物蛋白經(jīng)消化吸收的氨基酸外源性氨基酸與體內(nèi)組織蛋白降解產(chǎn)生的氨基酸內(nèi)源性氨基酸混在一起，分布于體內(nèi)各處參與代謝，稱為氨基酸代謝庫。,肌肉50●肝臟10腎臟4●血漿16,食物蛋白質(zhì),尿素,體內(nèi)非必需氨基酸合成,,,,,,,,,,,,,,,氨,酮體,?－酮酸,氧化供能,組織蛋白質(zhì),葡萄糖,其他含氮化合物（嘌呤、嘧啶等）,胺類,氨基酸代謝庫,,小結(jié),氨基酸的來源與去路,1、營養(yǎng)必需氨基酸ESSENTIALAMINOACID體內(nèi)不能合成，必需由食物供給的氨基酸，包括纈、異亮、苯丙、蛋、亮、色、蘇、賴。2、氮平衡NITROGENBALANCE攝入氮排出氮，即氮的“收支”平衡，反映正常成人的蛋白質(zhì)代謝情況。3、食物蛋白質(zhì)的互補作用營養(yǎng)價值較低的食物蛋白質(zhì)合理搭配、混合食用，從而互補必需氨基酸的不足，提高營養(yǎng)價值。,4、氨基酸的吸收主動吸收Γ谷氨?；h(huán)需谷胱甘肽5、蛋白質(zhì)的腐敗作用腐敗作用PUTREFACTION未被吸收的氨基酸及未被消化的蛋白質(zhì)在大腸菌中的代謝作用。6、組織蛋白質(zhì)的降解溶酶體內(nèi)降解不依賴ATP依賴泛素的降解過程依賴ATP，泛素介導(dǎo),第二節(jié)氨基酸的一般代謝,氨基酸的脫氨基作用?酮酸的代謝氨的代謝,GENERALMETABOLISMOFAMINOACIDS,1、轉(zhuǎn)氨基作用,,一、氨基酸的脫氨基作用,谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）,谷草轉(zhuǎn)氨酶GOT,谷丙轉(zhuǎn)氨酶GLUTAMICPYRUVICTRANSAMINASEGPT（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALANINETRANSAMINASE,ALT谷草轉(zhuǎn)氨酶GLUTAMICOXALOACETICTRANSAMINASEGOT天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶ASPARTATETRANSAMINASE,AST,血清轉(zhuǎn)氨酶活性可作為疾病診斷和預(yù)后的指標之一,正常人各組織GOT及GPT活性單位/克濕組織,轉(zhuǎn)氨酶的輔酶維生素Ｂ６的磷酸酯,轉(zhuǎn)氨酶的作用機理,,,,,,,Ｎ,,OCH,,CH2OPO3H2,,,,OHCH3,H2NCH,CH2OPO3H2,,,,,Ｎ,,,,,,,OHCH3,磷酸砒哆醛,磷酸砒哆胺,轉(zhuǎn)氨基作用不僅是體內(nèi)多數(shù)氨基酸脫氨基的重要方式，也是機體合成非必需氨基酸的重要途徑。,通過此種方式并未產(chǎn)生游離的氨。,轉(zhuǎn)氨基作用的生理意義,2、L谷氨酸氧化脫氨基作用,3、聯(lián)合脫氨基作用,①轉(zhuǎn)氨基偶聯(lián)氧化脫氨基作用,②轉(zhuǎn)氨基偶聯(lián)嘌呤核苷酸循環(huán),（1）轉(zhuǎn)氨基偶聯(lián)氧化脫氨基作用,此種方式既是氨基酸脫氨基的主要方式，也是體內(nèi)合成非必需氨基酸的主要方式。主要在肝、腎組織進行。,氨基酸,谷氨酸,Α酮酸,Α酮戊二酸,H2ONAD,轉(zhuǎn)氨酶,NH3NADHH,L谷氨酸脫氫酶,（2）轉(zhuǎn)氨基偶聯(lián)嘌呤核苷酸循環(huán)組織骨骼肌、心肌,氨基酸生糖及生酮性質(zhì)的分類類別氨基酸生糖氨基酸甘、絲、纈、精、半胱、脯、羥脯、丙、組、谷、谷氨酰胺、天冬、天冬酰胺、蛋生酮氨基酸亮、賴生糖兼生酮氨基酸異亮、苯丙、酪、蘇、色,生成非必需氨基酸轉(zhuǎn)變成糖和脂類氧化供能,二、?酮酸的代謝,,琥珀酰COA,延胡索酸,草酰乙酸,Α酮戊二酸,檸檬酸,乙酰COA,丙酮酸,PEP,磷酸丙糖,葡萄糖或糖原,糖,,Α磷酸甘油,脂肪酸,脂肪,甘油三酯,乙酰乙酰COA,,,,,,,,,,酮體,,,,,CO2,,,CO2,,,,,,,氨基酸、糖及脂肪代謝的聯(lián)系,TAC,小結(jié),一、主要的脫氨基作用1、氧化脫氨LGLU脫氫酶2、轉(zhuǎn)氨基作用轉(zhuǎn)氨酶（其輔酶為磷酸吡哆醛/胺）3、聯(lián)合脫氨基作用轉(zhuǎn)氨基作用＋LGLU氧化脫氨（肝、腎）轉(zhuǎn)氨基作用＋嘌呤核苷酸循環(huán)（骨骼肌、心肌）,二、Α酮酸的代謝1、生成非必需氨基酸2、生糖或成脂生酮氨基酸LEU、LYS不能生成葡萄糖生酮兼生糖氨基酸PHE、TYR、TRP、THR、ILE生糖氨基酸其它氨基酸,三、氨的代謝,體內(nèi)氨的來源與去路,血氨20MG/ML，尿中苯丙氨酸、苯丙酮酸增高治療新生兒用低苯丙氨酸飲食控制血中苯丙氨酸濃度在310MG/ML，持續(xù)時間至少至68歲,2、色氨酸代謝,五支鏈氨基酸的代謝,纈氨酸,亮氨酸,異亮氨酸,,,NH3,轉(zhuǎn)氨基作用,相應(yīng)的A酮酸,,CO2,氧化脫羧基作用,相應(yīng)的脂酰COA,,B氧化,相應(yīng)的A、B烯脂酰COA,,,,,,,琥珀酰COA,乙酰COA及乙酰乙酰COA,乙酰COA及琥珀酰COA,1、MET腎上腺素、肌酸、肉毒堿、精胺、精脒、膽堿、CYS，等活性甲基形式SAM含有AMP組分MET→同型CYS活性硫酸PAPS（磷酸腺苷磷酸硫酸）以CYS為原料2、GLY嘌呤堿、血紅素、肌酸、結(jié)合膽汁酸、谷胱甘肽、一碳單位，等3、PHE→TYR兒茶酚胺（腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺）、黑色素、甲狀腺素白化病人體內(nèi)缺少酪氨酸酶苯丙酮尿癥缺少苯丙氨酸羥化酶，應(yīng)控制PHE的攝入,小結(jié),重要內(nèi)容1、重要名詞ESSENTIALAMINOACID；ONECARBONUNIT2、氨基酸脫氨基的主要方式；聯(lián)合脫氨基作用的特點3、氨的代謝去路及尿素合成的特點4、氨基酸的來源與去路；丙氨酸、天冬氨酸與谷氨酸與糖代謝、脂代謝的關(guān)系及基本過程5、個別氨基酸脫羧基作用轉(zhuǎn)變生成的活性物質(zhì)6、一碳單位代謝的特點7、芳香族氨基酸代謝轉(zhuǎn)變生成的活性物質(zhì)，該代謝異常時可能出現(xiàn)的遺傳病的生化特點8、含硫氨基酸在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)變生成的活性物質(zhì),

簡介：分子生物學(xué)實驗室項目竣工環(huán)境保護驗收調(diào)查報告（噪聲、固體廢物污染防治設(shè)施）環(huán)城建工程字（2018）第0222號建設(shè)單位成都諾恩基因科技有限公司編制單位成都市環(huán)成建環(huán)保工程技術(shù)咨詢有限責(zé)任公司2018年6月附表附表1建設(shè)項目工程竣工環(huán)境保護“三同時”驗收登記表附圖附圖附圖1項目地理位置圖附圖2項目外環(huán)境關(guān)系及監(jiān)測布點圖附圖3項目總平面布置圖附圖4天府生命科技園總平面布置圖附件附件附件1公司更名備案通知書附件2項目環(huán)境影響報告表批復(fù)附件3天府生命科技園環(huán)境影響評價批復(fù)附件4項目房屋租賃合同附件5項目危廢處置協(xié)議附件6項目公眾意見調(diào)查表附件7驗收監(jiān)測報告附件8驗收委托書

簡介：MOLECULARBIOLOGYINMEDICINE醫(yī)學(xué)分子生物學(xué),許正平ZPXUZJUEDUCN,HTTP//WWWNOBELPRIZEORG/NOBEL_PRIZES/CHEMISTRY/LAUREATES/2012/POPULARCHEMISTRYPRIZE2012PDF,HTTP//WWWNOBELPRIZEORG/NOBEL_PRIZES/CHEMISTRY/LAUREATES/2012/POPULARCHEMISTRYPRIZE2012PDF,一、導(dǎo)論,定義從分子水平研究人體在正常和疾病狀態(tài)下生命活動及其規(guī)律的一門科學(xué)重點人體生物大分子和大分子體系的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用及其同疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,醫(yī)學(xué)分子生物學(xué),分子醫(yī)學(xué)MOLECULARMEDICINE,THEGREATESTINTELLECTUALREVOLUTIONOFTHELAST40YEARSMAYHAVETAKENPLACEINBIOLOGYCANANYONEBECONSIDEREDEDUCATEDTODAYWHODOESNOTUNDERSTANDALITTLEABOUTMOLECULARBIOLOGY─FHWESTHEIMERHARVARDUNIVERSITY,MOLECULARMEDICINEISABROADFIELD,WHEREPHYSICAL,CHEMICAL,BIOLOGICALANDMEDICALTECHNIQUESAREUSEDTODESCRIBEMOLECULARSTRUCTURESANDMECHANISMS,IDENTIFYFUNDAMENTALMOLECULARANDGENETICERRORSOFDISEASE,ANDTODEVELOPMOLECULARINTERVENTIONSTOCORRECTTHEM,MOLECULARMEDICINE,GFPANDOTHERFPSFLUORESCENTPROTEINS,TELOMEREDNAPROTECTSTHECHROMOSOMES,HTTP//WWWNOBELPRIZEORG/MEDIAPLAYER/INDEXPHPID1781,UNLOCKINGTHESECRETSOFOURCELLS,THELAUREATESTALKABOUTTHEIRBACKGROUND,THEIRWORK,ANDTHESTORYBEHINDTHEIRGROUNDBREAKINGRESEARCHLEADINGSCIENTISTSEXPLAINHOWTHISWORKHASINFLUENCEDTHEM,ANDPATIENTSTELLUSHOWTHEYHAVEBEENHELPEDBYTHESEMEDICALDEVELOPMENTS,VESICLETRAFFICINGGETTHERIGHTMOLECULESTOTHERIGHTPLACEATTHERIGHTTIME,HTTP//WWWNOBELPRIZEORG/NOBEL_PRIZES/MEDICINE/LAUREATES/2013/PRESSHTML,GENENORTHERNBLOTTINGWESTERNBLOTTING微陣列技術(shù)GENECHIP,MICROARRAY,PROTEINCHIP,分子生物學(xué)主要研究技術(shù),基因操縱技術(shù)GENEKNOCKOUT/KNOCKINRNAINTERFERENCERNAI蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控RIBOSOMEPROFILINGGTISEQ蛋白質(zhì)鑒定質(zhì)譜蛋白質(zhì)相互作用酵母雙雜交、免疫共沉淀（COIP）、PULLDOWN、FRET、表面等離子共振技術(shù)SPR蛋白質(zhì)與核酸相互作用CHIP、CHIPONCHIP、RIP研究生物大分子三維結(jié)構(gòu)常用的實驗手段X射線晶體學(xué)、核磁共振、原子力顯微鏡、X射線小角散射、電子顯微學(xué)、冷凍電子顯微鏡等。,醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)主要研究內(nèi)容,基因、遺傳與疾病的關(guān)系環(huán)境與健康的關(guān)系疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機制個體化治療的分子基礎(chǔ)治療有效性判斷的分子基礎(chǔ)。。。,醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)對臨床實踐的貢獻,疾病預(yù)測與預(yù)防疾病相關(guān)基因基因多態(tài)性疾病診斷生物標志物疾病治療基因治療、細胞治療、器官移植、再生醫(yī)學(xué)藥物研發(fā)靶向治療技術(shù)靶向藥物個體化治療技術(shù)個體化用藥生殖健康產(chǎn)前診斷、植入前診斷孕期檢查新生兒篩查,醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)與精準醫(yī)學(xué),實驗室研究（科學(xué)家）1）利用分子、細胞生物學(xué)等研究手段闡明疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制2）篩選疾病診斷的生物標志物3）確定疾病治療/干預(yù)的靶點4）藥物創(chuàng)制臨床實踐（醫(yī)生）基于分子醫(yī)學(xué)的臨床決策1）風(fēng)險預(yù)測基因組醫(yī)學(xué)2）疾病診斷生物標志物3）疾病治療個體化醫(yī)療臨床科學(xué)家（科學(xué)家醫(yī)生）即看病又做研究,教材醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（第3版）參考書MOLECULARCELLBIOLOGYGENEMOREINFORMATIONLITERATUREINTERNET,

簡介：白血病分子生物學(xué),,白血病分子生物學(xué),白血病的分子機制白血病的分子檢測白血病分子檢測的臨床應(yīng)用,白血病的分子機制,基因GENE合成有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列。癌基因ONCOGENE細胞或病毒中存在的，能誘導(dǎo)正常細胞轉(zhuǎn)化并使之獲得新生物特征的基因。癌基因活化的方式點突變?nèi)旧w重排基因擴增抑癌基因TUMORSUPPRESSORGENES指一類基因，其產(chǎn)物對細胞生長增殖起負調(diào)控的作用，并能潛在抑制細胞的惡變。,白血病的分子機制,,白血病的分子機制,增殖過度分化阻斷凋亡受抑,“二次打擊”學(xué)說,DGARYGILLILANDBESTPRACTICE16409417,白血病的分子檢測,SOUTHERNBLOTNORTHERNBLOTWESTERNBLOTFISHPCR測序芯片,白血病的分子檢測,PCR反應(yīng)原理,NN0X1ENN擴增子數(shù)量N0起始模板數(shù)量E擴增效率N循環(huán)數(shù),白血病的分子檢測,PCR理論方程,白血病的分子檢測,PCR方法優(yōu)點快速靈敏特異PCR方法缺點假陽性假陰性,白血病的分子檢測,PCR僅適用于染色體斷裂點叢集于相對小的范圍內(nèi)（90CML患者BCRABL融合蛋白（P210）的酪氨酸蛋白激酶活性較正常ABL高，可能是BCR對ABL激酶活性調(diào)節(jié)區(qū)的作用所致由于1012IG和TCR體細胞高頻突變造成的多樣性僅限于成熟B淋巴細胞,IG/TCR基因重排,VDJ重排IGH,TCRB,TCRDVJ重排LΚ,LΛ,TCRA,TCRG,IG/TCR基因重排,謝謝,

簡介：1分子生物學(xué)常用溶液配制分子生物學(xué)常用溶液配制一、分子生物學(xué)常用一、分子生物學(xué)常用貯存液的配制存液的配制130丙烯酰烯酰胺溶液胺溶液【配制方法】將29G丙烯酰胺和1GN，N’亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ML的水中。加熱至37℃溶解之，補加水至終體積為100ML。用濾器（045ΜM孔徑）過濾除菌，查證該溶液的PH值應(yīng)不大于70，置棕色瓶中保存于室溫?！咀⒁狻勘０肪哂泻軓姷纳窠?jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時應(yīng)戴手套和面具。可認為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹慎操作，因為它還可能會含有少量未聚合材料。一些價格較低的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺通常含有一些金屬離子，在丙烯酰胺貯存液中加入大約02體積的單床混合樹脂（MB1MALLINCKRODT），攪拌過夜，然后用WHATMAN1號濾紙過濾以純化之。在貯存期間，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會緩慢轉(zhuǎn)化成丙烯酰和雙丙烯酸。240丙烯酰烯酰胺【配制方法】把380G丙烯酰胺（DNA測序級）和20GN，N’亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為600ML的蒸餾水中。繼續(xù)按上述配制30丙烯酰胺溶液的方法處理，但加熱溶解后應(yīng)以蒸餾水補足至終體積為1L?！咀⒁狻恳娚鲜雠渲?0丙烯酰胺的說明40丙烯酰胺溶液用于DNA序列測定。3放放線菌素菌素D溶液溶液【配制方法】把20MG放線菌素D溶解于4ML100乙醇中，110稀釋貯存液，用100乙醇作空白對照讀取OD440值。放線菌素D（分子量為1255）純品在水溶液中的摩爾消化系數(shù)為21，900，故而1MGML的放線菌素D溶液在440NM處的吸光值為0182，放線菌素D的貯存液應(yīng)放在包有箔片的試管中，保存于20℃?！咀⒁狻糠啪€菌素D是致畸劑和致癌劑配制該溶液時必須戴手套并在通風(fēng)櫥內(nèi)操作而不能在開放在實驗桌面上進行謹防吸入藥粉或讓其接觸到眼睛或皮膚。藥廠提供的作治療用途的放線菌素D制品常含有糖或鹽等添加劑。只要通過測量貯存液在440NM波長處的光吸收確定放線菌素D的濃度，這類制品便可用于抑制自身引導(dǎo)作用。401MOLL腺苷三磷酸（腺苷三磷酸（ATP）溶液）溶液【配制方法】在08ML水中溶解60MGATP用01MOLLNAOH調(diào)至PH值至70，用蒸餾水定容1ML，分裝成小份保存于70℃510MOLL乙酸乙酸酰溶液溶液【配制方法】把770G乙酸酰溶解于800ML水中，加水定容至1L后過濾除菌。610過硫酸硫酸銨溶液溶液31305MOLLEDTAPH80溶液溶液【配制方法】在800ML水中加入1861G二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTANA2H2O），在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NAOH調(diào)節(jié)溶液的PH值至80（約需20GNAOH顆粒）然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用?！咀⒁狻縀DTA二鈉鹽需加入NAOH將溶液的PH值調(diào)至接近80才能完全溶解。14溴化乙溴化乙錠（10MGML溶液）溶液）【配制方法】在100ML水中加入1G溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫?！咀⒁狻啃⌒匿寤义V是強誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶液時務(wù)必戴上手套，稱量染料時要戴面罩。152HEPES緩沖鹽溶液溶液【配制方法】用總量為90ML的蒸餾水溶解16GNACL、0074GKCL、0027GNA2PO42H2O、02G葡聚糖和1GHEPES，用05MOLLNAOH調(diào)節(jié)PH值至705，再用蒸餾水定容至100ML。用022ΜM濾器過濾除菌，分裝成5ML小份，貯存于20℃。16IPTG溶液溶液【配制方法】IPTG為異丙基硫代ΒD半乳糖苷（分子量為2383），在8ML蒸餾水中溶解2GIPTG后，用蒸餾水定容至10ML，用022ΜM濾器過濾除菌，分裝成1ML小份貯存于20℃。171MOLL乙酸乙酸鎂溶液溶液【配制方法】在800ML水中溶解21446G四水乙酸鎂，用水定容至1L過濾除菌。181MOLLMGCL2溶液溶液【配制方法】在800ML水中溶解2034GMGCL26H2O，用水定容至1L，分裝成小份并高壓滅菌備用。【注意】MGCL2極易潮解，應(yīng)選購小瓶（如100G）試劑，啟用新瓶后勿長期存放。19Β巰基乙醇（基乙醇（BME）溶液）溶液【配制方法】一般得到的是144MOLL溶液，應(yīng)裝在棕色瓶中保存于4℃。【注意】BME或含有BME的溶液不能高壓處理。20NBT溶液溶液【配制方法】把05G氯化氮藍四唑溶解于10ML70的二甲基甲酰胺中保存于4℃。21酚酚氯仿溶液仿溶液

簡介：1分子生物學(xué)和免疫學(xué)的一些前沿領(lǐng)域研究的新技術(shù)和新方法一、分子生物學(xué)1基因組學(xué)和后基因組學(xué)的研究人類基因組研究計劃（HUMANGENOMICPROJECTHGP）于1990年正式開始實施，主要科學(xué)目標是研究基因組的結(jié)構(gòu)，繪制遺傳連鎖圖、物理圖、序列圖和轉(zhuǎn)錄圖。近年來寄生蟲基因組的研究已經(jīng)開始，其中瘧原蟲和溶組織阿米巴基因組計劃已宣布全部完成。血吸蟲，包蟲等還在進行中。主要內(nèi)容有新基因的發(fā)現(xiàn)，物理圖譜的制作，CDNA微型矩陣的制作，線粒體基因的測序以及生物信息學(xué)的研究等。應(yīng)用于血吸蟲基因組計劃研究采用的主要技術(shù)有熒光原位雜交（FISH），表達序列標簽（EST），DNA芯片微陣技術(shù)（CHIPMICROARRAY）。隨著基因組計劃的即將完成，目前已開始進入“后基因組學(xué)”時代，即識別和鑒定基因組的功能信息。后基因組學(xué)研究內(nèi)容主要有基因的識別和鑒定以及基因功能信息的提取和鑒定。目前識別基因的生物學(xué)手段主要基于以下原理和思路①根據(jù)已知基因序列資料。②根據(jù)可表達序列標簽（EST）。③對染色體特異性COS進行直接的CDNA選擇。④根據(jù)CPG島。⑤差異顯示及相關(guān)原理。⑥外顯子捕獲及相關(guān)原理。⑦DNA微芯片技術(shù)。該技術(shù)可用于任何位點基因突變、缺失和插入等的鑒定，感染性疾病和腫瘤的檢測，易患傾向基因的檢測，新基因的發(fā)現(xiàn)，基因作圖和基因表達研究等方向。DNA芯片技術(shù)在蚊蟲抗性基因和瘧原蟲耐藥基因的研究等項目中已經(jīng)應(yīng)用。⑧基因組掃描。⑨突變檢測體系?；蚬δ苄畔⒌奶崛】刹扇∠铝蟹椒á倮L制基因圖，包括所有的基因及等位基因，系統(tǒng)鑒定基因突變體。②繪制基因表達譜，采用微點陣技術(shù)（MICROARRAY）、定量PCR、原位雜交及計算機參與，用于定量分析基因表達水平。③基因敲除（GENEKNOCKOUT）或轉(zhuǎn)基因動物的建立，用以檢測模式生物的生物學(xué)功能改變，這是了解特定基因功能的重要途徑之一。④探測蛋白質(zhì)水平、修飾狀態(tài)和相互作用。采用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜法相結(jié)合，并通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比較的方法識別蛋白質(zhì)片段，檢測磷酸化和糖基化二級修飾。采用DNA靶檢測技術(shù)，構(gòu)建基因組相互作用圖。采用X線衍射技術(shù)和核磁共振技術(shù)對蛋白質(zhì)進行空間構(gòu)型分析，以研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，并判斷相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系。采用顯微鏡定位定量技術(shù)和FISH、CONFOCAL等新技術(shù)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能及相互作用進行分析，以了解基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。3酰肌醇化蛋白，GPIGLYCOSYLPHOSPHATIDYLINOSITOL，在曼氏血吸蟲SM23成蟲表膜以及許多原蟲表面抗原，如錐蟲表膜抗原變異體（VSG）、瘧原蟲裂殖體的表面抗原和蛋白酶中均已檢出。目前研究較多的是糖蛋白，蛋白中的糖鏈和肽鏈的連接方式有兩種N糖苷鍵和O糖苷鍵。曼氏血吸蟲循環(huán)陰極抗原（CCA）存在N糖苷鏈，而循環(huán)陽極抗原CAA不存在N糖苷鏈。曼氏血吸蟲雄蟲合成的糖蛋白含有O糖苷鏈。開展糖生物學(xué)研究，首先要檢測糖復(fù)合物的存在并進行組分分析，糖復(fù)合物的檢測包括糖部分和非糖部分。糖類的檢測比蛋白質(zhì)和核酸更為復(fù)雜，這是因為糖類沒有特征的吸收光譜，不能用分光光度法進行檢測。糖類的檢測通常都是利用特殊的化學(xué)反應(yīng)使糖類顯色，然后再比色測定。但是即使是簡單的單糖因其所含羥基的不同和其它取代基的存在，也無法用統(tǒng)一方法進行檢測。要了解糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能以及進一步研究其合成和調(diào)控，還需應(yīng)用糖復(fù)合物的分離純化技術(shù)，對其組成分析和測定后方可測定各個組分的結(jié)構(gòu)，不但要測定糖鏈的結(jié)構(gòu)，還需了解糖鏈和非糖部分的連接情況，尤其是糖蛋白。糖類復(fù)合物和其它生物分子一樣，只有在和其它分子相互作用時，才能體現(xiàn)它們的功能，因此功能研究應(yīng)包括糖鏈的相互作用以及作用中的其它非糖類的重要成分。最終可用改造糖鏈結(jié)構(gòu)和糖基化工程制備糖復(fù)合物。這一方面的研究雖然剛剛起步，但發(fā)展趨勢令人注目，為糖復(fù)合物的疫苗和藥物研制提供了一條新途徑。二、免疫學(xué)近30年來，免疫學(xué)獲得巨大發(fā)展，并取得了許多突破性成果。免疫學(xué)對寄生蟲學(xué)的滲透和交叉又推動了寄生蟲病防治工作，在寄生蟲病免疫學(xué)診斷和疫苗研究以及寄生蟲感染的免疫病理研究方面均取得重大成果。這里簡單介紹近年來新發(fā)展的一些免疫學(xué)技術(shù)和方法。1細胞因子測定隨著越來越多的細胞因子基因克隆和功能應(yīng)用研究的深入，細胞因子檢測從早期的非特異生物活性檢測發(fā)展到特異生物活性檢測，這一技術(shù)在寄生蟲病機制研究及流行病學(xué)調(diào)查中得到迅速的發(fā)展。細胞因子檢測可應(yīng)用于①反映機體免疫狀態(tài)，判斷疫苗接種后宿主產(chǎn)生細胞免疫的狀態(tài)及效果。②分析細胞因子在機會感染寄生蟲致病患者中的療效，分析流行社區(qū)人群中細胞免疫狀況及其在免疫力產(chǎn)生中的作用和影響。③分析細胞因子的藥

簡介：分子生物學(xué)筆記分子生物學(xué)筆記第一章基因的結(jié)構(gòu)第一節(jié)基因和基因組一、基因GENE是合成一種功能蛋白或RNA分子所必須的全部DNA序列一個典型的真核基因包括1編碼序列外顯子EXON2插入外顯子之間的非編碼序列內(nèi)合子INTRON35端和3端非翻譯區(qū)UTR④調(diào)控序列可位于上述三種序列中絕大多數(shù)真核基因是斷裂基因SPLITGENE，外顯子不連續(xù)。二、基因組GENOME一特定生物體的整套單倍體遺傳物質(zhì)的總和，基因組的大小用全部DNA的堿基對總數(shù)表示。人基因組3X10930億BP，共編碼約10萬個基因。每種真核生物的單倍體基因組中的全部DNA量稱為C值，與進化的復(fù)雜性并不一致CVALUEPARADOX。人類基因組計劃（HUMANGENOMEPROJECTHGP）基因組學(xué)（GENOMICS）結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（STRUCTURALGENOMICS）和功能基因組學(xué)（FUNCTIONALGENOMICS）。蛋白質(zhì)組（PROTEOME）和蛋白質(zhì)組學(xué)（PROTEOMICS）第二節(jié)真核生物基因組一、真核生物基因組的特點，1真核基因組DNA在細胞核內(nèi)處于以核小體為基本單位的染色體結(jié)構(gòu)中2真核基因組中，編碼序列只占整個基因組的很小部分23％，二、真核基因組中DNA序列的分類一高度重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)LO5衛(wèi)星DNASATELLITEDNA二中度重復(fù)序列1中度重復(fù)序列的特點1重復(fù)單位序列相似，但不完全一樣，2散在分布于基因組中3序列的長度和拷貝數(shù)非常不均一，④中度重復(fù)序列一般具有種屬特異性，可作為DNA標記⑤中度重復(fù)序列可能是轉(zhuǎn)座元件返座子，2中度重復(fù)序列的分類1長散在重復(fù)序列LONGINTERSPERSEDREPEATEDSEGMENTSLINES2短散在重復(fù)序列SHTINTERSPERSEDREPEATEDSEGMENTSSINESSINES長度105如人ALU序列LINES長度1000BP可達7KB拷貝數(shù)104105，如人LINEL三單拷貝序列UNIQUESEQUENCE包括大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因和基因間間隔序列，三、基因家族GENEFAMILY人線粒體基因組的特點1、人線粒體基因組為16，569BP的雙鏈閉環(huán)分子，一條鏈為重鏈H鏈，一條鏈為輕鏈L鏈，兩條鏈均有編碼功能，每個MTDNA分于編碼13種蛋白質(zhì)和24種結(jié)構(gòu)RNA22RRNA，2TRNA2、線粒體DNA為母系遺傳3、結(jié)構(gòu)基因不含內(nèi)含子，部分區(qū)域有基因重疊，因此病理性MTDNA突變更易發(fā)生4、MTDNA突變頻率更高5、線粒體DNA突變的表型表達與核DNA不同。第四節(jié)細菌和病毒基因組一、細菌基因組的特點。1功能相關(guān)的幾個結(jié)構(gòu)基因往往串聯(lián)在起，受它們上游的共同調(diào)控區(qū)控制，形成操縱子結(jié)構(gòu)，2結(jié)構(gòu)基因中沒有內(nèi)含子，也無重疊現(xiàn)象。3細菌DNA大部分為編碼序列。二、病毒基因組的特點1每種病毒只有一種核酸，或者DNA，或者RNA；2病毒核酸大小差別很大，3X103一3X106BP；3除逆病毒外，所有病毒基因都是單拷貝的。4大部份病毒核酸是由一條雙鏈或單鏈分子RNA或DNA，僅少數(shù)RNA病毒由幾個核酸片段組成5真核病毒基因有內(nèi)含子，而噬菌體（感染細菌的病毒）基因中無內(nèi)含子6有重疊基因第五節(jié)染色質(zhì)和染色體細胞分裂間期染色質(zhì)CHROMATIN分裂期染色體CHROMOSOME一、染色質(zhì)的基本單位核小體一核小體NUCLEOSOME結(jié)構(gòu)DNA繞在組蛋白八聚體H2A、H2B、H3、H4各一對核心外18周146BP形成核小體核心顆粒。兩個核小體核心顆粒之間有LINKERDNA080BP，核小體核心顆粒LINKER核小體長180210BP核小體DNALADDER二組蛋白HISTONE一類小的帶有豐富正電荷富含LYS，ARG的核蛋白，與DNA有高親和力組蛋白分類1核小體核心組蛋白，H2A，H2B，H3，H4。分子量較小102135AA作用盤繞DNA形成核小體。2H1組蛋白較大220AA，作用與LINKERDNA結(jié)合后利于核小體穩(wěn)定和更高級結(jié)構(gòu)的形成。二、染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)1、30NM染色質(zhì)纖絲，2、袢環(huán)結(jié)構(gòu)LOOPEDDOMAIN。3、細胞分裂期染色體分裂期染色體一對姐妹染色單體（CHROMATID

簡介：分子生物學(xué)分子生物學(xué)碩士研究生招生考試大綱碩士研究生招生考試大綱第一章第一章緒論緒論1、掌握分子生物學(xué)概念和研究內(nèi)容；2、DNA是遺傳物質(zhì)的特征及實驗驗證；3、分子生物學(xué)的發(fā)展簡史。第二章第二章DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)1、掌握DNA遺傳物質(zhì)的本質(zhì)；2、掌握核酸的化學(xué)組成、DNA的二級結(jié)構(gòu)；3、掌握DNA的變性和復(fù)性的概念、過程以及影響因素；4、了解超螺旋和拓撲異構(gòu)體（酶）的概念、超螺旋狀態(tài)的描述和形成趨勢、拓撲異構(gòu)體（酶）的種類和作用方式。第三章第三章有機體、染色體和基因有機體、染色體和基因1、掌握原核生物基因組織的特點；2、掌握真核生物染色體組裝和壓縮的過程；3、掌握C值和C值矛盾的概念、表現(xiàn)以及原因；4、掌握真核生物基因組的DNA類型；5、掌握基因簇與基因家族的概念。第四章第四章DNA的復(fù)制的復(fù)制1、掌握DNA的半保留復(fù)制的概念和實驗證明；2、掌握DNA復(fù)制起始機制、復(fù)制方式；3、掌握與DNA復(fù)制相關(guān)酶學(xué)；4、大腸桿菌DNA復(fù)制的過程；5、了解原核和真核生物各自復(fù)制的特殊性。第五章第五章DNA的損傷、修復(fù)和突變的損傷、修復(fù)和突變1、掌握錯配修復(fù)、光復(fù)活、切除修復(fù)、重組修復(fù)和SOS修復(fù)的過程；2、掌握原核生物的限制－修飾現(xiàn)象；3、了解基因內(nèi)和基因間回復(fù)突變（抑制突變）的分子機制；4、了解突變類型、突變劑的種類和突變生成、突變熱點的概念和例子。第六章第六章轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄1、掌握轉(zhuǎn)錄、有義鏈、反義鏈、轉(zhuǎn)錄單位等基本概念；2、掌握原核生物RNA轉(zhuǎn)錄的起始、延伸、終止和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工；3、掌握真核生物RNA轉(zhuǎn)錄的起始、延伸、終止和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工；4、掌握真核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中內(nèi)元的分類和切除；5、掌握不連續(xù)轉(zhuǎn)錄和反式拼接概念和發(fā)現(xiàn)。第七章第七章蛋白質(zhì)翻譯蛋白質(zhì)翻譯1、掌握蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基本元件；2、掌握蛋白質(zhì)合成的分子過程；3、掌握保證蛋白質(zhì)合成準確的分子機制；4、掌握蛋白質(zhì)前體的加工與轉(zhuǎn)運機制。第八章第八章原核生物基因表達調(diào)控原核生物基因表達調(diào)控1、掌握基因表達調(diào)控的空間密碼；2、掌握乳糖操縱元（LACOPERON）的組成和調(diào)控；3、掌握TRPOPERON及弱化作用機理；4、了解原核生物基因轉(zhuǎn)錄的時序調(diào)控、翻譯水平的調(diào)控和DNA序列重排對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。第九章第九章真核生物基因表達調(diào)控真核生物基因表達調(diào)控1、掌握真核生物DNA水平的調(diào)控；2、掌握真核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控；3、掌握真核生物轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控的方式（RNA編輯）；5、了解真核生物翻譯和翻譯后水平的調(diào)控的例子。第十章第十章遺傳重組遺傳重組1、掌握同源重組的特征、機制、原核同源重組的過程；3、掌握位點專一性重組的特征、ΛPHAGE的整合與切除的過程；4、掌握轉(zhuǎn)座子的概念、原核生物轉(zhuǎn)座重組的特點和種類。