簡介:,第三章病毒和亞病毒,第三章病毒與亞病毒,第一節(jié)病毒第二節(jié)亞病毒第三節(jié)病毒與實踐,第一節(jié)病毒,概述病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)病毒的復(fù)制病毒的溶原性病毒對理化因素抵抗力,一、病毒的特點和定義,第一節(jié)概述,1、特點,1)不具有細胞結(jié)構(gòu),具有一般化學(xué)大分子的特征。,2)一種病毒的毒粒內(nèi)只含有一種核酸,DNA或者RNA。,3)大部分病毒沒有酶或酶系極不完全,不含催化能量代謝的酶,不能進行獨立的代謝作用。,4)嚴格的活細胞內(nèi)寄生,沒有自身的核糖體,沒有個體生長,也不進行二均分裂,必須依賴宿主細胞進行自身的核酸復(fù)制,形成子代。,5)個體微小,在電子顯微鏡下才能看見。,6)對大多數(shù)抗生素不敏感,對干擾素敏感。,例如一些簡單的病毒僅由核酸和蛋白質(zhì)外殼(COAT)構(gòu)成,故可把它們視為核蛋白分子。,朊病毒甚至僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成,病毒感染敏感宿主細胞后,病毒核酸進入細胞,通過其復(fù)制與表達產(chǎn)生子代病毒基因組和新的蛋白質(zhì),然后由這些新合成的病毒組分裝配(ASSEMBLY)成子代毒粒,并以一定方式釋放到細胞外。病毒的這種特殊繁殖方式稱做復(fù)制(REPLICATION)。,第一節(jié)概述,1、特點,一、病毒的特點和定義,病毒是一類既具有化學(xué)大分子屬性,又具有生物體基本特征;既具有細胞外的感染性顆粒形式,又具有細胞內(nèi)的繁殖性基因形式的獨特生物類群。,,超顯微的、沒有細胞結(jié)構(gòu)的、專性活細胞內(nèi)寄生的實體,第一節(jié)概述,1、特點,一、病毒的特點和定義,單細胞微生物與病毒性質(zhì)的比較,ADNA病毒和RNA病毒中的一部分B利福平可抑制痘病毒復(fù)制,第一節(jié)概述,2、定義,一、病毒的特點和定義,迄今仍無一個科學(xué)而嚴謹?shù)亩x,病毒為具有獨立于其宿主的進化史的絕對細胞內(nèi)寄生物,它的DNA或RNA基因組被其所編碼的蛋白質(zhì)殼體化(ENCAPSIDATION)。(FIELDS等,1990年),非細胞生物,,(真)病毒至少含核酸和蛋白質(zhì)二種組分,亞病毒SUBVIRUS,,類病毒(VIROID只含具侵染性的RNA組分擬病毒(VIRUSOID只含有不具侵染性的RNA組分朊病毒(PRION只含蛋白質(zhì),,二病毒的宿主范圍,第一節(jié)概述,病毒幾乎可以感染所有的細胞生物,并具有宿主特異性,,,噬菌體(PHAGE)、植物病毒(PLANTVIRUSES)動物病毒(ANIMALVIRUSES),三、病毒的培養(yǎng)和純化,第一節(jié)概述,同微生物學(xué)其他學(xué)科分支一樣,病毒學(xué)的進步完全得益于研究方法和技術(shù)手段的發(fā)展。,通過病毒的分離與純化獲得純化的、有感染性的病毒制備物是病毒學(xué)研究和實踐的基本技術(shù)。,1、病毒的培養(yǎng),病毒的培養(yǎng)二元培養(yǎng)物法,四、病毒的培養(yǎng)和純化,1、病毒的培養(yǎng),噬菌體,,細菌培養(yǎng)物,,培養(yǎng)液,營養(yǎng)瓊脂平板,,細菌培養(yǎng)液變清亮,細菌平板成為殘跡平板,,若是噬菌體標本經(jīng)過適當(dāng)稀釋再接種細菌平板,經(jīng)過一定時間培養(yǎng),在細菌菌苔上可形成圓形局部透明區(qū)域,即噬斑(PLAGUE)。,MICROBIOLOGY,雙層平板法,優(yōu)點①彌補玻璃皿底面不平的缺陷②所形成全部噬菌體斑都接近處于同一平面上③形成的噬菌斑較大,更有利于計數(shù),MICROBIOLOGY,噬菌斑,四、病毒的培養(yǎng)和純化,1、病毒的培養(yǎng),動物病毒,,,實驗動物,雞胚,多種細胞培養(yǎng),四、病毒的培養(yǎng)和純化,1、病毒的培養(yǎng),植物病毒,,敏感植物葉片,,產(chǎn)生壞死斑,或稱枯斑,蛋白質(zhì)提純方法(鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、凝膠層析、離子交換等),四、病毒的培養(yǎng)和純化,2、病毒純化,標準,,純化的病毒制備物應(yīng)保持其感染性,病毒是有感染性的生物體,,病毒具有化學(xué)大分子的屬性,,純化的病毒制備物的理化性質(zhì)應(yīng)具有均一性,方法,,主要化學(xué)組成為蛋白質(zhì),,具有一定的大小、形狀和密度,,,差速離心,梯度離心(超速離心),第二節(jié)毒粒的性質(zhì),病毒是一類既具有化學(xué)大分子屬性,又具有生物體基本特征;既具有細胞外的感染性顆粒形式,又具有細胞內(nèi)的繁殖性基因形式的獨特生物類群。,毒粒(病毒顆粒)病毒的細胞外顆粒形式,也是病毒的感染性形式。,一團能夠自主復(fù)制的遺傳物質(zhì),保護遺傳物質(zhì)免遭環(huán)境破壞,并作為將遺傳物質(zhì)從一個宿主細胞傳遞給另一個宿主細胞的載體。,蛋白質(zhì)外殼,包膜,,,,第二節(jié)毒粒的性質(zhì),一、毒粒的形態(tài)結(jié)構(gòu),1、病毒的大小和形狀,個體小,必需在電鏡下觀察;,不同病毒的毒粒大小差別很大;,毒粒的形狀動物病毒有球狀、卵圓狀、磚形植物病毒有桿狀、絲狀、球狀噬菌體有蝌蚪狀和絲狀,,,,采用各種電鏡技術(shù)觀察毒粒的形態(tài)結(jié)構(gòu),ORFVIRUS口瘡病毒接觸性膿皰皮炎病毒(負染技術(shù)),EBOLAVIRUS埃博拉病毒(正染技術(shù)),VACCINIAVIRUS痘苗病毒(投影技術(shù)),甲型H1N1型流感病毒,SARS病毒,第二節(jié)毒粒的性質(zhì),毒粒的化學(xué)組成,毒粒(化學(xué)組成),,核酸;蛋白質(zhì);脂類;碳水化合物;,,基本化學(xué)組成,,病毒顆粒在化學(xué)上表現(xiàn)為核蛋白,二、毒粒的化學(xué)組成,1、病毒的核酸,核酸是病毒的遺傳物質(zhì);一種病毒的毒粒只含有一種核酸DNA或是RNA;,病毒核酸,,單鏈DNA(SSDNA,SINGLESTRANDEDDNA);雙鏈DNA(DSDNA);單鏈RNA(SSRNA);雙鏈RNA(DSRNA);,二、毒粒的化學(xué)組成,2、病毒的蛋白質(zhì),病毒蛋白質(zhì),,結(jié)構(gòu)蛋白,非結(jié)構(gòu)蛋白,病毒基因組編碼的,在病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生并具有一定功能,但并不結(jié)合于毒粒中的蛋白質(zhì)。,構(gòu)成一個形態(tài)成熟的有感染性的病毒顆粒所必需的蛋白質(zhì),,,殼體蛋白;包膜蛋白;存在于毒粒中的酶;,二、毒粒的化學(xué)組成,2、病毒的蛋白質(zhì),病毒結(jié)構(gòu)蛋白的主要生理功能,1)構(gòu)成蛋白質(zhì)外殼,保護病毒核酸免受核酸酶及其它理化因子的破壞;,2)決定病毒感染的特異性,與易感細胞表面存在的受體具特異性親和力,促使病毒粒子的吸附和入侵;,3)決定病毒的抗原性,能刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體;,4)構(gòu)成毒粒酶,或參與病毒對宿主細胞的入侵(如T4噬菌體的溶菌酶等),或參與病毒復(fù)制過程中所需要病毒大分子的合成(如逆轉(zhuǎn)錄酶等);,一般來說,病毒是不具酶或酶系極不完全的,所以一旦離開宿主就不能獨立進行代謝和繁殖。,第二節(jié)病毒的性質(zhì),2、病毒的殼體結(jié)構(gòu),殼體或衣殼(CAPSID),包圍著病毒核酸的蛋白質(zhì)外殼,由蛋白質(zhì)亞基按對稱的形式、有規(guī)律地排列而成,是病毒毒粒的基本結(jié)構(gòu)。,殼體結(jié)構(gòu)類型,,螺旋對稱殼體二十面體對稱殼體復(fù)合對稱結(jié)構(gòu),螺旋對稱殼體亞基有規(guī)律地沿著中心軸(核酸)呈螺旋排列,進而形成高度有序、對稱的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。,二十面體對稱殼體構(gòu)成對稱結(jié)構(gòu)殼體的第二種方式是蛋白質(zhì)亞基圍繞具立方對稱的正多面體的角或邊排列,進而形成一個封閉的蛋白質(zhì)的鞘。,具有復(fù)合對稱結(jié)構(gòu)的典型例子是有尾噬菌體(TAILEDPHAGE),其殼體由頭部和尾部組成。包裝有病毒核酸的頭部通常呈二十面體對稱,尾部呈螺旋對稱。,一、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu),3、病毒的包膜結(jié)構(gòu),病毒包膜的基本結(jié)構(gòu)與生物膜相似,是脂雙層膜。在包膜形成時,細胞膜蛋白被病毒的包糖蛋白取代。刺突(SPIKE)包膜或核衣殼上的突起。,第二節(jié)病毒的性質(zhì),一、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu),3、病毒的包膜結(jié)構(gòu),病毒的蛋白質(zhì)殼體和病毒核酸(核心)構(gòu)成的復(fù)合物,又稱核衣殼。,核殼(NUCLEOCAPSID),僅由核衣殼構(gòu)成的病毒顆粒,裸露毒粒(NAKEDVIRION),如煙草花葉病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒(POLIOVIRUS)等一些簡單的病毒的毒粒。,包膜(ENVELOPE),有些病毒核衣殼包裹著的一層脂蛋白膜,它是病毒以出芽(BUDDING)方式成熟時,由細胞膜衍生而來的。有維系毒粒結(jié)構(gòu),保護病毒核殼的作用。特別是病毒的包膜糖蛋白,具有多種生物學(xué)活性,是啟動病毒感染所必需的。,有包膜的病毒,,第二節(jié)病毒的性質(zhì),一、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu),4、病毒的結(jié)構(gòu)類型,四種主要結(jié)構(gòu)類型,,裸露的二十面體;裸露的螺旋;有包膜的二十面體;有包膜的螺旋;,有些病毒,如有尾噬菌體、痘病毒等結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,不能包括在這些結(jié)構(gòu)類型之內(nèi)。,不同病毒的毒粒結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度有很大的區(qū)別,3、三類典型形態(tài)的病毒及其代表,二十面體對稱的代表腺病毒,復(fù)合對稱的代表T偶數(shù)噬菌體,螺旋對稱的代表煙草花葉病毒TMV,(1)螺旋對稱的代表煙草花葉病毒TOBACOMOSAICVIRUS,TMV,,,有三種類型纖維狀、直桿狀和彎曲桿狀。衣殼形似一中空柱,內(nèi)包核酸,衣殼粒和核酸呈螺旋對稱形排列。由95%衣殼PR和5%SSRNA組成。蛋白質(zhì)衣殼由衣殼粒(2130個)一個緊挨一個地呈螺旋排列而成,SSRNA位于衣殼內(nèi)側(cè)螺旋狀溝中。,(2)二十面體對稱的代表-腺病毒ADENOVIRUS,具有20個面,30條邊和12個頂角。核衣殼由不同數(shù)量的衣殼粒按一定方式排列成對稱體。腺病毒粒子共由252個球形的衣殼粒排列成一個具有廿面的對稱體,線狀DSDNA。噬菌體X174只有12個衣殼粒,最大的廿面體是由1,472個衣殼粒組成的昆蟲病毒粒子。,絕大多數(shù)噬菌體為蝌蚪形,現(xiàn)以ECOLIT4為例,介紹蝌蚪形噬菌體的結(jié)構(gòu),大腸桿菌T4噬菌體構(gòu)造,(3)復(fù)合對稱的代表-T偶數(shù)噬菌體,,,95NM,95NM,,65NM,,24環(huán),頸環(huán),,3、病毒的群體形態(tài),包涵體INCLUSIONBODY,噬菌斑PLAQUE,空斑PLAQUE,枯斑LESION,,,病毒的群體形態(tài)有,(1)包涵體(INCLUSIONBODY),概念感染病毒的宿主細胞內(nèi),出現(xiàn)在光學(xué)顯微鏡下可見的大小、形態(tài)、數(shù)量不等的小體,稱為包涵體。在宿主細胞內(nèi)形成包涵體是病毒的特征,不同的病毒其形成的包涵體具有不同的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、和特性。,包涵體在細胞中的形成部位位于細胞核內(nèi)如包疹病毒位于細胞質(zhì)內(nèi)如狂犬病毒等胞核內(nèi)胞質(zhì)都有麻疹病毒,包涵體(INCLUSIONBODY),是病毒的聚集體,是病毒的合成部位,是病毒蛋白和與病毒感染有關(guān)的蛋白質(zhì),非病毒性包涵體,由化學(xué)因子或細菌感染形成,包涵體的實踐意義病毒鑒定、臨床診斷依據(jù)。,2噬菌斑PLAQUE,,噬菌斑是指在宿主細菌的菌苔上,噬菌體使菌體裂解而形成的空斑。,應(yīng)用1、噬菌體定量計數(shù)2、噬菌體的鑒定,空斑和病斑,在動物細胞培養(yǎng)物上的與噬菌斑類似的空斑,稱為病斑因為受腫瘤病毒感染??瞻吆筒“哂糜趧游锊《玖W拥挠嫈?shù)也可以采用噬菌斑法類似的技術(shù)。,枯斑植物病毒在植物葉片上形成的群體稱為枯斑。,第三節(jié)病毒的復(fù)制,病毒的特點,嚴格細胞內(nèi)寄生物,只能在活細胞內(nèi)繁殖。,毒粒,,宿主細胞,,有繁殖性的病毒基因組,,具有感染性的毒粒消失,病毒基因組復(fù)制、表達,,病毒核酸和蛋白質(zhì),裝配形成具有感染性的毒粒,,釋放至細胞外,,,,,原料;能量;生物合成場所;,,第三節(jié)病毒的復(fù)制,病毒的復(fù)制,病毒感染敏感宿主細胞后,病毒核酸進入細胞,通過其復(fù)制與表達產(chǎn)生子代病毒基因組和新的蛋白質(zhì),然后由這些新合成的病毒組分裝配(ASSEMBLY)成子代毒粒,并以一定方式釋放到細胞外。病毒的這種特殊繁殖方式稱做復(fù)制(REPLICATION)。,第三節(jié)病毒的復(fù)制,一、病毒的復(fù)制周期,1、一步生長曲線(ONESTEPGROWTHCURVE),1939年,MAXDELBRUCKEMORYELLIS,ECOLI/BACTERIOPAGE,1、用噬菌體的稀釋液感染高濃度的宿主細胞;2、數(shù)分鐘后,加入抗噬菌體的抗血清(中和未吸附的噬菌體);3、將上述混合物大量稀釋,終止抗血清的作用和防止新釋放的噬菌體感染其它細胞;4、保溫培養(yǎng)并定期檢測培養(yǎng)物中的噬菌體效價(對噬菌體含量進行計數(shù));5、以感染時間為橫坐標,病毒的感染效價為縱坐標,繪制出病毒特征性的繁殖曲線;,該實驗標志著分子病毒學(xué)、分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的建立MAXDELBRUCK因此榮獲1969年NOBELPRIZE,一、病毒的復(fù)制周期,1、一步生長曲線(ONESTEPGROWTHCURVE),噬菌體復(fù)制(繁殖)的三個階段(吸附期);游離的噬菌體吸附到宿主細胞1、潛伏期;從噬菌體吸附到細胞到釋放出新噬菌體的最短時期2、裂解期;隨著菌體不斷破裂,新噬菌體數(shù)目增加,直到最高值3、平穩(wěn)期;,一、病毒的復(fù)制周期,1、一步生長曲線(ONESTEPGROWTHCURVE),,,取培養(yǎng)物直接測定病毒數(shù)量,將培養(yǎng)物過濾去細胞后測定病毒數(shù)量,將細胞裂解后測定病毒的數(shù)量。前期可將培養(yǎng)物先離心去上清以消除未吸附病毒的影響,,裂解量每個受染細胞所產(chǎn)生的子代病毒顆粒的平均數(shù)目。其值等于潛伏期受染細胞的數(shù)目除以穩(wěn)定期受染細胞所釋放的全部子代病毒數(shù)目,即等于穩(wěn)定期病毒效價與潛伏期病毒效價之比。,一、病毒的復(fù)制周期,2、隱蔽期(ECLIPSEPERIOD),,在潛伏期的前一段,受染細胞內(nèi)檢測不到感染性病毒,后一階段,感染性病毒在受染細胞內(nèi)的數(shù)量急劇增加。自病毒在受染細胞內(nèi)消失到細胞內(nèi)出現(xiàn)新的感染性病毒的時間為為隱蔽期。,隱蔽期病毒在細胞內(nèi)存在的動力學(xué)曲線呈線性函數(shù),而非指數(shù)關(guān)系,從而證明子代病毒顆粒是由新合成的病毒基因組與蛋白質(zhì)經(jīng)裝配成熟,而不是通過雙分裂方式產(chǎn)生的。,不同病毒的隱蔽期長短不同,例如,DNA動物病毒的隱蔽期為5~20小時,RNA動物病毒為2~10小時。,,一、病毒的復(fù)制周期,1、一步生長曲線(ONESTEPGROWTHCURVE),一步生長曲線是研究病毒復(fù)制的一個經(jīng)典試驗,最初是為研究噬菌體的復(fù)制而建立,以后推廣到動物病毒和植物病毒的復(fù)制研究中。,以適量的病毒接種于標準培養(yǎng)的高濃度的敏感細胞,待病毒吸附后,離心除去未吸附的病毒,或以抗病毒抗血清處理病毒細胞培養(yǎng)物以建立同步感染,然后繼續(xù)培養(yǎng)并定時取樣測定培養(yǎng)物中的病毒效價,并以感染時間為橫坐標,病毒的感染效價為縱坐標,繪制出病毒特征性的繁殖曲線,即一步生長曲線。,不同病毒的潛伏期長短不同,噬菌體以分鐘計,動物病毒和植物病毒以小時或天計。,潛伏期,噬菌體的裂解量一般為幾十到上百個,植物病毒和動物病毒可達數(shù)百乃至上萬個。,裂解量,一、病毒的復(fù)制周期,3、病毒的復(fù)制周期,復(fù)制周期(REPLICATIVECIRCLE)或稱復(fù)制循環(huán),自病毒吸附于細胞開始,到子代病毒從感染細胞釋放到細胞外的病毒復(fù)制過程。,①吸附;②侵入;③增殖;(包括病毒基因組的表達與復(fù)制)④裝配(成熟)⑤釋放(裂解);,第三節(jié)病毒的復(fù)制,二、病毒感染的起始,1、吸附,毒粒,敏感細胞,隨機碰撞而接觸(靜電引力或氫鍵),可逆吸附,無特異性(非細胞顆粒也可吸附),,,病毒表面蛋白與細胞受體的結(jié)合,特異性,不可逆吸附,啟動病毒感染的第一階段,二、病毒感染的起始,1、吸附,病毒吸附蛋白與細胞受體間的結(jié)合力來源于空間結(jié)構(gòu)的互補性,相互間的電荷、氫鍵、疏水性相互作用及范得華力。,不同種系的細胞具有不同病毒的細胞受體,病毒受體的細胞種系特異性決定了病毒的宿主范圍。,二、病毒感染的起始,2、侵入,侵入又稱病毒內(nèi)化,它是一個病毒吸附后幾乎立即發(fā)生,依賴于能量的感染步驟。不同的病毒宿主系統(tǒng)的病毒侵入機制不同,二、病毒感染的起始,2、侵入,有尾噬菌體,注射方式將噬菌體核酸注入細胞,通過尾部刺突固著于細胞;尾部的酶水解細胞壁的肽聚糖,是細胞壁產(chǎn)生小孔;尾鞘收縮,核酸通過中空的尾管壓入胞內(nèi),蛋白質(zhì)外殼留在胞外;,吸附,尾釘固著,尾鞘收縮,尾管穿入,DNA注入,如果大量噬菌體在短時間內(nèi)吸附于同一細胞上,使細胞壁產(chǎn)生許多小孔,也可引起細胞立即裂解,但并未進行噬菌體的增殖,這種現(xiàn)象稱為自外裂解(LYSISFROMWITHOUT)。,二、病毒感染的起始,2、侵入,植物病毒,通過因人為地或自然的機械損傷所形成的微傷口進入細胞;或者靠攜帶有病毒的媒介,主要靠是有吮吸式口器的昆蟲取食將病毒帶入細胞。,植物病毒一旦進入細胞后,增殖產(chǎn)生的子代病毒或病毒核酸可通過病毒編碼的運動蛋白(MOVEMENTPROTEIN)與胞間連絲的相互作用從受染細胞進入鄰近細胞。,二、病毒感染的起始,脫殼,脫殼是病毒侵入后,病毒的包膜和/或殼體除去而釋放出病毒核酸的過程。脫殼是病毒基因組進行功能表達所必需的感染事件。,T偶數(shù)噬菌體脫殼與侵入是一起發(fā)生的,動物病毒存在不同的結(jié)構(gòu)類型和不同的侵入方式,其脫殼過程也較復(fù)雜。,第三節(jié)病毒的復(fù)制,三、增殖,病毒基因組進入胞內(nèi),,宿主細胞的代謝發(fā)生改變,,病毒利用宿主的生物合成機構(gòu)和場所,使病毒核酸表達和復(fù)制,產(chǎn)生大量的病毒蛋白質(zhì)和核酸。,④成熟(裝配),已合成的各部件進行自行裝配成新的噬菌體的過程。,T偶數(shù)噬菌體裝配過程模式圖,被感染細胞裂解,成熟的子代噬菌體轉(zhuǎn)移到外界。開始新的生活史。,,,⑤裂解(釋放),,裂解量平均每一宿主細胞裂解后所產(chǎn)生的子代噬菌體數(shù)。,,有囊膜病毒以“出芽”方式釋放,吸附,侵入,早期病毒特異性酶的合成,病毒核酸復(fù)制,病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)合成,裝配,釋放,,病毒大分子合成,2、噬菌體效價的測定,效價(噬菌斑形成單位數(shù)、感染中心數(shù))每ML樣品中所含有的具侵染性的噬菌體粒子數(shù)。,測定方法斑點試驗法、液體稀釋管法、單層平板法、雙層平板法、快速玻片法,,,,,,噬菌斑數(shù)試樣中噬菌體數(shù),雙層平板法,噬菌體與宿主關(guān)系,1、烈性噬菌體凡能引起宿主細胞迅速裂解的噬菌體。2、溫和性噬菌體噬菌體侵染宿主后,并不增殖,裂解,而與宿主DNA結(jié)合,隨宿主DNA復(fù)制而復(fù)制,此時細胞中找不到形態(tài)上可見的噬菌體,這種噬菌體稱為溫和性噬菌體。含有溫和性噬菌體的細菌稱為溶源性細菌LYSOGENICBACTERIA,第四節(jié)病毒的非增殖性感染,溫和噬菌體的溶源性反應(yīng),烈性噬菌體(VIRULENTPHAGE),感染宿主細胞后能在細胞內(nèi)正常復(fù)制并最終殺死細胞,形成裂解循環(huán)(LYTICCYCLE)。,溫和噬菌體或稱溶源性噬菌體(LYSOGENICPHAGE),感染宿主細胞后不能完成復(fù)制循環(huán),噬菌體基因組長期存在于宿主細胞內(nèi),沒有成熟噬菌體產(chǎn)生。,這一現(xiàn)象稱做溶源性(LYSOGENY)現(xiàn)象,在大多數(shù)情況下,溫和噬菌體的基因組都整合于宿主染色體中(如Λ噬菌體),亦有少數(shù)是以質(zhì)粒形成存在(如P1噬菌體)。,溫和性噬菌體存在狀態(tài),1)游離具感染性的VIRION;2)前噬菌體(PROPHAGE)附著或整合在宿主染色體上,一道復(fù)制;3)營養(yǎng)期噬菌體指導(dǎo)合成。,溫和噬菌體的溶源性反應(yīng),整合于細菌染色體或以質(zhì)粒形成存在的溫和噬菌體基因組稱做原噬菌體(PROPHAGE),在原噬菌體階段,噬菌體的復(fù)制被抑制,宿主細胞正常地生長繁殖,而噬菌體基因組與宿主細菌染色體同步復(fù)制,并隨細胞分裂而傳遞給子代細胞。,細胞中含有以原噬菌體狀態(tài)存在的溫和噬菌體基因組的細菌稱做溶源性細菌(LYSOGENICBACTERIA),溶源性細菌經(jīng)自發(fā)裂解或誘發(fā)裂解,進入裂解循環(huán),噬菌體的應(yīng)用,噬菌體會給人類造成損失,利用微生物進行發(fā)酵的工業(yè)常深受其害。但是,由于噬菌體的某些生物學(xué)特性,使其在人類的生產(chǎn)實踐和生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究中都有一定價值??筛爬橐韵聨追矫?。,1用于鑒定未知細菌在醫(yī)學(xué)上,有些難鑒別的病原菌,利用噬菌體對宿主細胞的高度?;缘拿舾行?,不僅可鑒定到菌種,而且可鑒定到菌型。2用于臨床治療某些傳染性疾病。如果將噬菌體制劑與抗生素或者磺胺藥物配合應(yīng)用,則效果更好。3檢驗植物病原菌利用噬菌體可以檢驗由種子攜帶的植物病原菌。4測定輻射劑量某些噬菌體如T2對輻射劑量的反應(yīng)敏感而精確。5噬菌體在分子生物學(xué)研究中的作用噬菌體現(xiàn)已成為進行分子生物學(xué)研究的較為理想的重要材料。,,,(二)植物病毒,,已知的植物病毒多達700種(1989年),多數(shù)是SSRNA病毒。形態(tài)桿、絲、球狀,一般無包膜。,1619年荷蘭畫師描畫的有病郁金香的畫像。,花葉、黃化或紅化等癥狀,植株發(fā)生矮化,叢枝或畸形等,形成枯斑或壞死等癥狀,植物感染病毒后的主要癥狀,植物黃萎病,,借昆蟲刺吸式口器進入、通過傷口或嫁接進入,再通過胞間連絲或輸導(dǎo)組織迅速向其它部位擴散引起普遍感染。,1、“侵入”方式,,3、核酸的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成,2、脫殼植物病毒侵入宿主細胞后才能發(fā)生脫殼。,,增殖過程,4、裝配(成熟),(三)人類和脊椎動物病毒,在人類與脊椎動物中廣泛寄生著相應(yīng)的病毒。人類傳染病80%由病毒引起(>300種),脊椎動物病毒>900種,許多病毒引起人畜共患病。另一些病毒感染動物后,并不致死宿主細胞,而是引起腫瘤。,種類,DSDNA、SSDNA、DSRNA、SSRNA。衣殼外有的有包膜,有的無包膜,有的包膜上有刺突。,增殖過程,與噬菌體的增殖大致相同,可分為五個連續(xù)步驟1)吸附具高度專一性地吸附于敏感細胞表面的受體。2)侵入以胞飲、包膜溶入細胞膜、特異受體轉(zhuǎn)移等方式侵入敏感細胞內(nèi)。3)脫殼脫去衣殼和包膜。4)生物合成核酸的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成。5)裝配和成熟分別合成的核酸和蛋白質(zhì)組合成完整的、新的病毒粒子。6)釋放大量有侵染性的子代病毒。,多角體多數(shù)昆蟲病毒可在宿主細胞內(nèi)形成光鏡下呈多角形的包涵體。直徑一般3ΜM(05~10ΜM),堿溶性蛋白,內(nèi)包裹數(shù)目不等的病毒粒,可在細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)形成。功能保護病毒粒免受外界不良環(huán)境的破壞。,(四)昆蟲病毒(無脊椎動物病毒),已知昆蟲病毒1671種(1990),其中80%以上鱗翅目昆蟲的病原體。,昆蟲病毒的種類,除非包涵體病毒病毒外,可分為,核型多角體病毒NUCLEARPOLYHEDROSISVIRUS,NPV,質(zhì)型多角體病毒CYTOPLASMICPOLYHEDROSISVIRUS,CPY,顆粒體病毒GRANULOSISVIRUS,GV,,昆蟲病毒做為生物農(nóng)藥優(yōu)點,專一性高,毒力大,后效長,使用方便,對人畜安全,無公害,缺點危害經(jīng)濟動物,,,,類病毒VIROID,擬病毒VIRUSOID,朊病毒PRION,第二節(jié)亞病毒,只含核酸或蛋白質(zhì)一種成分的分子病原體。,包括,一、類病毒,只含RNA一種成分,專性活細胞內(nèi)寄生的分子病原體。是寄生于高等生物細胞中一類最小的新的病原體。SSRNA,分子量約5104DA~12104DA,為已知最小病毒分子量的十分之一左右。到目前為止,類病毒只在植物中被發(fā)現(xiàn)。類病毒對各種化學(xué)和物理因子的作用都不敏感,對熱以及紫外光和離子輻射有高度抗性。,類病毒VIROID,馬鈴薯紡錘塊莖病的病原體,長50NM棒狀RNA分子,179核苷酸180核苷酸,RNA由,組成,兩半體間有70%堿基以氫鍵方式結(jié)合共形成122個堿基對,27個內(nèi)環(huán)。,VIROIDDISEASESOFPOTATO,二、擬病毒VIRUSOIDS,類類病毒,是包裹在動植物病毒粒子中的類病毒極其微小,僅由裸露的RNA(300~400個核苷酸)或DNA組成。,輔助病毒類病毒“寄生”的真病毒。擬病毒為輔助病毒的“衛(wèi)星”,其復(fù)制必須依賴輔助病毒的協(xié)助。擬病毒也可干擾輔助病毒的復(fù)制、減輕其對宿主的病害、用于生物防治中。,,,是一類不含核酸的侵染性蛋白質(zhì)分子。小型蛋白質(zhì)顆粒,分子量33104~35104DA,約由250個氨基酸組成。能引起宿主體內(nèi)現(xiàn)成的同類蛋白質(zhì)分子發(fā)生與其相似的構(gòu)象變化而使宿主致病。毒性很強,1G含朊病毒的鼠腦可感染1億只小鼠。,三、朊病毒,引起的疾病羊搔癢病、瘋牛病、瘋羊病、克雅氏病。,朊病毒侵入人體大腦的過程借食物進入消化道,再經(jīng)淋巴系統(tǒng)侵入大腦。,MICROBIOLOGY,朊病毒(PRION,VIRINO),朊病毒有哪些特點首先,它沒有核酸,能使正常的蛋白質(zhì)由良性轉(zhuǎn)為惡性,由沒有感染性轉(zhuǎn)化為感染性;其次,它沒有病毒的形態(tài),是纖維狀的東西;第三,它對所有殺滅病毒的物理化學(xué)因素均有抵抗力,現(xiàn)在的消毒方法都無用,只有在136℃高溫和兩個小時的高壓下才能滅活;第四,病毒潛伏期長,從感染到發(fā)病平均28年,一旦出現(xiàn)癥狀半年到一年100%死亡;第五,診斷困難,正常的人與動物細胞內(nèi)都有朊蛋白存在,不明原因作用下它的立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,變成有傳染性的蛋白,患者體內(nèi)不產(chǎn)生免疫反應(yīng)和抗體,因此無法監(jiān)測。,與真病毒的主要區(qū)別,(1)在電鏡下,朊病毒呈淀粉樣顆粒狀,成叢排列,每叢大小和形狀不一;(2)無核酸成分;(3)無免疫原性;(4)由宿主細胞內(nèi)的基因編碼;(5)抗逆性強,能耐殺菌劑(甲醛)和高溫(120~130℃處理4H后仍具感染性)。,人的庫魯病KURU、克雅氏病CREUTZFELDTJAKOBDISEASE,CJD等,羊搔癢癥SCRAPIE,牛海綿狀腦病SPONGIFORMENCEPHALOPATHY,第三節(jié)病毒與實踐,病毒與實踐的關(guān)系極密切,由病毒引起
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簡介:第七章口腔生物學(xué)實驗教程,提要口腔生物學(xué)實驗教程是針對口腔生物學(xué)理論課設(shè)計的實驗指導(dǎo)內(nèi)容。其教學(xué)目的是讓學(xué)生通過實驗,掌握基本的口腔生物學(xué)研究技術(shù)和方法,加深對理論課所學(xué)知識的理解,培養(yǎng)學(xué)生對口腔醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究的興趣,了解基本的科研設(shè)計思路,啟發(fā)學(xué)生的科研思維。,內(nèi)容目錄,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗實驗一菌斑的采集、染色和觀察、分類實驗二變異鏈球菌的分離和鑒定實驗三細菌代謝酸的測定實驗四細菌細胞外葡聚糖的測定實驗五菌斑中PH值的測定第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗實驗六齦溝液中堿性磷酸酶活性的測定實驗七唾液鈣和磷含量的測定實驗八唾液分泌情況的測定,第三節(jié)口腔疾病分子生物學(xué)實驗九以釉原蛋白基因進行性別鑒定第四節(jié)骨組織生物學(xué)和口腔細胞培養(yǎng)實驗十成骨細胞的分離培養(yǎng)實驗十一成骨細胞的分離培養(yǎng)實驗十二MTT法檢測細胞活性實驗十三腫瘤細胞遷移實驗(細胞劃痕法),內(nèi)容目錄,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,實驗一菌斑的采集、染色和觀察、分類,實驗?zāi)康呐c要求掌握牙菌斑標本的采集、處理和常用染色剛果紅(CONGORED)負性染色的主要程序和方法,熟悉齦上或齦下菌斑中常見細菌的形態(tài)及分類方法。實驗內(nèi)容菌斑標本的采集;細菌涂片的制備、染色;染色細菌的觀察及LISTGARTEN分類。實驗設(shè)備和器材等用品香柏油,二甲苯,菌斑染色劑,酒精,濃鹽酸和滅菌的液狀石蠟等。無菌牙科鑷子、挖匙或探針(齦上菌斑檢查用),載玻片,滅菌取菌環(huán)可卸式取菌器或消毒濾紙(齦下菌斑采集用),含預(yù)還原轉(zhuǎn)送培養(yǎng)基的帶蓋小瓶,普通光學(xué)顯微鏡,試鏡紙,細菌接種環(huán)及裝有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿等。,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,實驗方法,菌斑采集和處理,染色,觀察,分類,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,①齦溝內(nèi)采集法②牙周袋內(nèi)采集法,齦溝或牙周袋的齦下菌斑采集法,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,剛果紅負性染色方法,LISTGARTEN的分類標準,球菌菌細胞直徑05ΜM~10ΜM,包括少量球桿菌;直桿菌菌細胞寬05ΜM~15ΜM,長10ΜM~19ΜM,包括部分分支桿菌;絲狀菌菌細胞寬05ΜM~15ΜM,長與寬之比大于6∶1,菌細胞多為不規(guī)則的長絲狀桿菌;梭狀菌菌細胞直徑03ΜM~10ΜM,長約10ΜM,其末端呈梭狀;彎曲桿菌菌細胞呈新月形或彎曲狀;螺旋體菌細胞寬02ΜM~05ΜM,長約10ΜM~20ΜM,螺旋形,包括大、中、小三種螺旋體。,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,實驗結(jié)果與分析,注意事項1染色操作中,用濃鹽酸熏蒸涂片時要小心。2該法不能檢測細菌的活動性,但染色涂片可長期保存。思考題剛果紅負性染色有何優(yōu)點菌斑采集時應(yīng)該注意什么,齦上菌斑涂片剛果紅負性染色結(jié)果,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,實驗二變異鏈球菌的分離和鑒定,實驗?zāi)康暮鸵笸ㄟ^對菌落特點和菌細胞形態(tài)及革蘭染色特征的觀察,初步掌握菌斑標本中變異鏈球菌的分離、培養(yǎng)和表型鑒定的主要程序和方法,熟悉牙菌斑中常見細菌的菌落特點、菌細胞形態(tài)及革蘭染色特點。實驗原理變異鏈球菌能發(fā)酵蔗糖等多種碳水化合物,而其他口腔鏈球菌不發(fā)酵山梨醇和甘露醇;根據(jù)其菌落形態(tài)、染色特點及耐氧情況,以其特殊的生化反應(yīng)可以分離和鑒定變異鏈球菌。實驗內(nèi)容,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,主要實驗設(shè)備和器材、試劑等厭氧培養(yǎng)裝置如簡易厭氧袋、厭氧罐、厭氧培養(yǎng)箱或厭氧手套箱均可;普通孵箱,旋渦混合器,微量振蕩器,和普通光學(xué)顯微鏡??烧{(diào)式移液器、加樣頭,小試管,三角形推棒,接種環(huán)、酒精燈,載玻片,無菌棉簽,96孔反應(yīng)板,EP管;口腔檢查用口鏡,鑷子,檢查盤,無菌紗球,無菌探針和齦上鋤形潔治器。革蘭染色試劑,系列生化基質(zhì)和指示劑(包括甘露醇、山梨醇、菊糖、精氨酸試劑、七葉苷水解試劑)。變異鏈球菌ATCC25175懸液。MS瓊脂、BHI瓊脂培養(yǎng)基、巰基乙醇酸鹽轉(zhuǎn)送液,02MOL/L、PH70~的無菌磷酸鹽緩沖液PBS等。,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,實驗方法變異鏈球菌群細菌的分離和表型鑒定,菌斑標本,接種到MS或TS瓊脂上,微氧孵育(37℃、5~10CO248小時)或厭氧孵育(37℃48小時、90N210CO2或80N210CO210H2),菌落、菌細胞形態(tài)檢查,生化鑒定,確定菌種,,,,,,,次代培養(yǎng)純化、富集,分散、稀釋,置轉(zhuǎn)送液中運送,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,革蘭染色步驟,細菌涂片加熱固定,加革蘭(堿性結(jié)晶紫)甲液、乙液各一滴,混勻后初染30秒,革蘭碘液媒染30秒,丙酮乙醇混合脫色劑脫色5~10秒,石炭酸復(fù)紅復(fù)染5秒,干燥后1000倍顯微鏡油鏡下觀察,水洗,,,,,,水洗,水洗,水洗,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,表型鑒定(1)菌落特征觀察,初代培養(yǎng)的菌落觀察要點形態(tài)如水滴狀、圓形、絲狀、不規(guī)則狀、根狀、梭形等。大小菌落直徑一般以MM計,注意大小的一致性。厚薄扁平、丘狀、凸、半球狀、瘤狀中央凸。顏色無色、白、黃、紅、綠、黑或棕色。邊緣如整齊、鋸齒狀、波狀等。透明度透明、半透明、不透明。菌落型光滑、粗糙、黏液樣。溶血型Α、Β、Γ(限血平板)。,實驗結(jié)果及結(jié)果評價,在5~10CO2、90~95的N2,或80N2、10CO2和10H2的大氣環(huán)境下37℃孵育48小時,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,表型鑒定(2)菌細胞形態(tài)和染色特征觀察,菌細胞形態(tài)球形、桿形、球桿形、彎曲狀、梭狀、菌細胞末端形狀、細胞內(nèi)有無顆粒、腫脹等。革蘭染色特征陽性、陰性染色,染色均勻性。,實驗結(jié)果及結(jié)果評價,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,生化鑒定,革蘭染色鑒定次代培養(yǎng)為純培養(yǎng)后,收集瓊脂表面的菌苔,用PBS稀釋成2109/ML菌量,取待測的細菌懸液100ΜL,加入10個反應(yīng)板微孔中,分別加入100ΜL不同的生化基質(zhì),各加2孔,同時加PBS為陰性對照,加變異鏈球菌ATCC25175為陽性對照,振搖混合30秒后,37℃孵育4小時24小時,取出反應(yīng)板,加入指示劑,觀察記錄結(jié)果,,,,,,實驗結(jié)果及結(jié)果評價,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,生化鑒定反應(yīng)板微量快速生化實驗名稱、試劑及結(jié)果,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,反應(yīng)板微量快速生化實驗利用細菌產(chǎn)生的預(yù)成酶(胞外酶),在37℃普通孵箱中與生化試劑基質(zhì)產(chǎn)生特異的酶反應(yīng),通過各種指示劑或特殊的顯色產(chǎn)物即可在4小時~24小時觀察到結(jié)果。反應(yīng)板微量快速生化實驗的生化鑒定系統(tǒng)包括30個生化實驗基質(zhì)與相關(guān)指示劑、磷酸鹽緩沖液(PBS)、細菌標準濁度管以及8個鑒定系列,可根據(jù)細菌的形態(tài)、染色性及耐氧實驗結(jié)果選擇不同的系列生化基質(zhì)進行鑒定。這8個鑒定系列是①革蘭陽性厭氧球菌②革蘭陰性厭氧球菌③革蘭陽性無芽胞厭氧桿菌④革蘭陰性無芽胞厭氧桿菌A不產(chǎn)黑色素的革蘭陰性厭氧短桿菌;B產(chǎn)黑色素的革蘭陰性厭氧短桿菌;C革蘭陰性厭氧梭狀或長桿菌⑤革蘭陰性彎曲菌⑥梭菌屬⑦變異鏈球菌和其他口腔鏈球菌⑧微需氧的革蘭陰性厭氧桿菌,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,菌種鑒定變異鏈球菌群細菌的鑒別,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,實驗注意事項,要設(shè)陽性和陰性對照。細菌濃度對實驗結(jié)果的影響濃度低可導(dǎo)致假陰性結(jié)果,最佳的細菌濃度為211010/ML~241010/ML,如菌濃度略低可適當(dāng)延長酶反應(yīng)時間。酶反應(yīng)時間與菌種的關(guān)系酶反應(yīng)時間因不同菌種有所差異,以4小時~24小時為宜。待測標本放置時間以新鮮的放置24小時~48小時培養(yǎng)物為宜。如標本不能立即做生化實驗,可將其放置在4℃冰箱內(nèi),時間最好不超過96小時。預(yù)成酶微量生化實驗所用細菌應(yīng)來自不加血的非選擇培養(yǎng)基,以避免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。,實驗報告變異鏈球菌的分離與鑒定。思考題變異鏈球菌的菌細胞形態(tài)特征、菌落特征、耐氧特征和生化反應(yīng)特征主要有哪些,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,實驗三細菌代謝酸的測定,實驗?zāi)康呐c要求學(xué)習(xí)用色譜技術(shù)定性和定量檢測分析細菌代謝脂肪酸的基本方法。實驗原理各種脂肪酸在色譜柱(固定相)及流動相中的分配系數(shù)、吸附能力不同,導(dǎo)致它們在柱中的保留時間有所差異。同種酸停留時間相同;峰面積與含量正相關(guān)。實驗內(nèi)容1液體純培養(yǎng)增菌。2色譜層析技術(shù)測定細菌培養(yǎng)液中短鏈脂肪酸的種類及相對含量。實驗主要設(shè)備、器材等色譜儀,細菌培養(yǎng)箱,離心機,PH計,三角燒瓶,接種環(huán),移液器,微量注射器和EP管等。,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,實驗方法,樣品制備,色譜層析,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,實驗結(jié)果分析結(jié)果計算培養(yǎng)液中各組分保留時間與標準酸圖譜比較定性,按下式計算C有機酸,注意事項實驗前要用流動相平衡分析柱;注意溫度對分析結(jié)果有影響。,實驗報告與評定細菌代謝酸測定。思考題色譜層析實驗中哪些方面非常重要細菌代謝酸的測定除了采用色譜層析技術(shù)以外,還可以用哪些方法測定,AREA有機酸,AREA標準C標準,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,實驗四細菌細胞外葡聚糖的測定,實驗?zāi)康呐c要求變異鏈球菌可以產(chǎn)生葡糖基轉(zhuǎn)移酶,綜合蔗糖產(chǎn)生細胞外多糖即水溶性或不溶水葡聚糖。通過實驗要掌握用比色法測定葡聚糖含量的方法和原理。實驗原理糖在強酸溶液中加熱,脫水生成羥醛,再變成呋喃衍生物。此衍生物可以與各種試劑反應(yīng)生成有色物質(zhì),然后用分光光度計測得密度值,進而計算出糖的含量。以蒽酮法為例,其可與單糖、雙糖、糊精和淀粉反應(yīng)生成有色化合物,在一定的濃度范圍內(nèi),測得的葡聚糖含量與光密度值成正比。實驗內(nèi)容蒽酮法測定變異鏈球菌培養(yǎng)液中細胞外葡聚糖的含量。,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,實驗主要設(shè)備和器材蒽酮試劑稱取200MG蒽酮溶解于100ML濃硫酸中攪拌溶解。4℃冰箱可保存2~3周。葡聚糖標準儲存液稱取10G葡聚糖,溶于100ML水中制成儲存液。使用時吸取10ML稀釋至100ML,儲存于4℃冰箱中。分光光度計,離心機,10ML試管,恒溫水浴箱,水浴鍋及吸管,移液器,氫氧化鈉等。,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,實驗方法,樣品處理將水溶性和非水溶性多糖分開測定,即,測定將水溶性和非水溶性多糖分開測定,即,1標準曲線按下表配制標準液。攪拌3分鐘后放入95℃水浴中加熱6分鐘,冷卻,用分光光度計測量波長625NM的光密度值,繪制標準曲線。,2樣品測定取樣品10ML質(zhì)量濃度在20ΜG/L~40ΜG/L為宜,加蒽酮試劑3ML,95℃水浴煮沸6分鐘,冷卻后測其625NM處的OD值,根據(jù)標準曲線及稀釋倍數(shù)計算樣品中葡聚糖的含量。,注意事項配置標準液時應(yīng)在15℃水浴中加入蒽酮。實驗報告評定細菌細胞外葡聚糖的測定。思考題細菌細胞外多糖有幾種如何分別檢測這些細菌細胞外多糖,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,實驗五菌斑中PH值的測定,實驗?zāi)康呐c要求菌斑PH的測定可分為兩大類,即活體測定與離體測定。電極接觸法TOUCHPHELECTRODEMETHOD活體測定埋藏電極遙測法INTRAORALORINDWELLINGPHELECTRODESYSTEMS離體測定如人工菌斑法,實驗內(nèi)容1電極接觸法是活體菌斑PH檢測法,即將手持的微電極置于原位的菌斑表面來測定菌斑的PH。2埋藏電極遙測法是體內(nèi)檢測方法。3人工菌斑法人工菌斑法是先建立人工菌斑模型,然后用未刺激和刺激的唾液同菌斑作用,同時電極測定PH變化。實驗主要設(shè)備和器材微電極,吸液用注射器,PH計,隔濕用消毒棉球等。,,,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,1電極接觸法是活體菌斑PH檢測法,即手持微電極測定菌斑PH的方法。(1)用注射器吸取1ML標準PH溶液,滴入電極敏感端部位,校正PH計。(2)受試者2天不漱口刷牙,測試前2小時不進食。(3)用棉卷隔濕并用氣槍吹干測試部位。(4)測定“靜態(tài)”PH手持微電極置于原位的菌斑表面,待離子計數(shù)穩(wěn)定時記錄PH值。每一時間點測試受試者同一顆牙的上下左右4個位點,取其平均值即為菌斑原位PH值,且4個位點在1分鐘內(nèi)完成測試。(5)測定動態(tài)PH受試者可先測定靜態(tài)PH值;再讓受試者進食不同的食物,在一定的時間間隔中測定動態(tài)PH;也可分別測定齲齒敏感部及鄰牙界面的PH。(6)測試操作①測定時,將微型玻璃電極或銻電極直接插入要測的牙菌斑中;②參比電極通過飽和氯化鉀鹽橋與受檢者身體相連,多放在前臂或口底;③PH計也可連接自動描繪裝置,將測到的PH直接繪制成圖。,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,2埋藏電極遙測法是菌斑PH的體內(nèi)檢測方法。(1)用注射器吸取1ML標準PH溶液滴入電極敏感端部,校正PH計。(2)將一個微型玻璃電極埋入離體的釉質(zhì)小塊中。(3)用棉卷隔濕并用氣槍吹干測試區(qū)域。(4)將埋入釉質(zhì)小塊中的微型玻璃電極放入局部義齒中,戴入受檢者口腔內(nèi)缺牙的部位,讓電極的敏感面向著基牙的鄰面和咬合面。也可在電極的后方接一個微型的場效應(yīng)晶體管,以增加傳導(dǎo)速度,提高敏感性,減少干擾。(5)參比電極的接法一般與接觸法相同,或者也埋入義齒中,以細導(dǎo)線與口外連接。(6)根據(jù)實驗要求觀察菌斑在電極頭的聚集和PH變化情況。(7)電極敏感端的菌斑可以確定為類似于鄰面或窩溝部位的牙菌斑。,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,3人工菌斑法是先建立人工菌斑模型,然后用未刺激和刺激的唾液同菌斑作用,同時用電極測定PH變化。在整個測試過程中,人工唾液均處于流動狀態(tài),且流速可變。,實驗報告評定菌斑中PH值的測定。思考題三種測試PH的方法各有何優(yōu)缺點,注意事項菌斑中PH值受多方面因素的影響,如口腔環(huán)境、唾液、飲食的酸堿度以及口腔清潔情況等,因此測定時要做好隔濕防護。,第一節(jié)口腔微生物學(xué)實驗,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,實驗?zāi)康呐c要求牙周炎處齦溝液中該酶的活性變化與牙周袋探診深度和炎癥程度明顯正相關(guān),與牙周炎破壞和牙周組織狀況相關(guān)。通過實習(xí)要求掌握齦溝液中ALP的基本檢測方法。實驗原理ELISA法定量測定ALP,實驗內(nèi)容1齦溝液樣品采集與制備;2ELISA法測定ALP的染色操作;3酶標儀測定吸光度值,確定ALP的相對含量。,實驗六齦溝液中堿性磷酸酶活性的測定,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,齦溝液采集,洗提,ELISA法檢測ALP,酶標儀測定OD450NM值,,,,實驗方法,主要實驗設(shè)備和器材,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,注意事項齦溝液的量少,易受多種因素影響,采集時動作要輕柔,排除全身影響因素(如生理周期、性激素等)和局部刺激因素,并注意防止污染。每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔不同于空白孔,測量時先用此孔調(diào)OD值至零。嚴格按規(guī)定的時間和溫度進行孵育。所有試劑必須在用前恢復(fù)至室溫;用后應(yīng)立即冷藏。洗板很重要,在加入檢測溶液B或底物前要盡量吸干孔內(nèi)液體,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。實驗時酶標板加蓋或覆膜,以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,避免酶標板長時間處于干燥狀態(tài)。,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,注意事項操作時要帶手套,板底勿殘留的液體和手指印,否則影響OD值的準確性。在儲存和孵育時要避免強光直接照射,底物避光保存,在儲存和溫育時避免強光直接照射。未用完的酶標板或試劑務(wù)必于2℃~8℃保存,避免不準確稀釋而造成的濃度誤差;檢測液及底物溶液要在用前配制,且應(yīng)37℃溫育30分鐘。加樣或加試劑時,應(yīng)注意減少時間間隔,以保證準確性及重復(fù)性。一次加樣時間包括標準品及所有樣品最好控制在10分鐘以內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用多道移液器加樣。建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準確性。,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,實驗結(jié)果及分析根據(jù)齦溝液中ALP含量檢測的OD值結(jié)果、空白對照等,分析實驗結(jié)果。思考題哪些因素能影響齦溝液中堿性磷酸酶的含量測定,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,實驗七(1)唾液鈣含量的測定,目的和要求了解分光光度法的定量原理,熟悉減少實驗誤差、提高準確度的方法和操作技術(shù),掌握利用市售試劑盒測定唾液中鈣濃度的原理和方法。,實驗原理,實驗主要用品和設(shè)備,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,實驗方法1唾液收集及處理收集非刺激性唾液約05ML,3000R/MIN離心10MIN,取上清液備測。2分光光度計測定準備三組EP管,按下表順序分別加入試劑3各管在振蕩器上混勻,以空白管校正零點,在分光光度計上測定612NM波長下的OD值,按下式計算含量樣品中鈣的濃度(MMOL/L樣品管光密度/標準管光密度25,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,思考題試分析誤差產(chǎn)生的原因含量計算的方法有哪些,注意事項為保證測試結(jié)果的可靠性,所有實驗器皿一定要清洗干凈且用三蒸水多次沖洗、烤干后待用。也可在試劑中加入少量的EDTA作掩蔽劑,消除實驗器皿和試劑中的鈣污染,在試劑中加入8羥基喹嚀以去除鎂的干擾。為避免玻璃中的鈣離子溶出,鈣標準貯存液用塑料瓶保存。為提高分析結(jié)果的準確度,減少偶然誤差,應(yīng)增加平行測定次數(shù)。本實驗所測結(jié)果為唾液中總鈣濃度。,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,實驗七(2)唾液中磷含量測定,目的和要求了解分光光度法的定量原理,熟悉減少實驗誤差、提高準確度的方法和操作技術(shù),掌握比色法測定唾液中磷含量的原理和方法。,實驗原理,實驗內(nèi)容1收集口腔唾液;2測定唾液中總鈣含量。實驗設(shè)備和用品,硫酸,還原,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,實驗方法和步驟,1標本收集及處理收集非刺激性唾液05ML,取02ML,加10三氯醋酸38ML,充分混勻,放置10MIN,3000R/MIN離心10MIN,取上清液備測。2測定準備三組EP管,按表74順序分別加入試劑,3結(jié)果計算C唾液(MG/ML)A樣品/A標準C標準A樣品/A標準0005MG/ML,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,注意事項為了保證測試結(jié)果的可靠性,所有實驗器皿一定要清洗干凈且用三蒸水多次沖洗,烤干后待用。為了避免玻璃中的磷離子溶出,磷標準貯存液用塑料瓶保存。為了提高分析結(jié)果的準確度,減少偶然誤差,應(yīng)增加平行測定次數(shù)。本實驗所測結(jié)果為唾液中總磷濃度。,思考題1唾液中磷含量測定誤差的種類有哪些2含量計算的方法有哪些,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,實驗八唾液分泌情況的測定,實驗?zāi)康呐c要求唾液分泌量及成分的測定對一些疾病診治效果的評估有重要意義。通過實習(xí)要求掌握靜態(tài)流率和靜態(tài)流率的測量意義和方法,掌握單個腺體分泌測定的方法,為將來臨床研究奠定基礎(chǔ)。實驗內(nèi)容1靜態(tài)唾液總流率的測定;2動態(tài)唾液總流率的測定;3單個腺體唾液分泌的測定。材料、用品及設(shè)備消毒的帶漏斗試管和普通試管,無菌棉球或棉墊,天平,色層分析紙,LASHLEY杯,01MOL/L枸櫞酸或1G膠姆,或方糖等。,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,實驗方法1靜態(tài)唾液總流率測定常用測定方法包括吸取法DRAINING手持帶漏斗的試管,使唾液沿下唇逐漸流入試管,至結(jié)束時,受試者將口內(nèi)剩余唾液全部吐入試管。通常收取15分鐘,計算單位時間的唾液量。吐取法SPITTING使唾液在口底聚集,受試者每隔60秒將其吐入試管,一般收集10分鐘,低于1ML/10MIN為異常減低。吸引法SUCTION用負壓吸引器將唾液自口底持續(xù)吸入試管,吸引頭置于舌下。棉墊法SWAB將每個約024CM06CM的棉墊預(yù)先稱重,置于口內(nèi)各唾液腺導(dǎo)管開口處,收集后稱重。吐取法及吸取法相對常用,操作簡便,還可用于動態(tài)唾液總流率的測定。而吸引法和棉墊法會產(chǎn)生一定刺激,操作相對復(fù)雜,目前多不使用。,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,實驗方法2動態(tài)唾液總流率測定常用測定方法包括酸刺激法將01MOL/L枸櫞酸滴于舌背前部,每次4滴,受試者將舌尖后卷,分泌唾液用吐取法收集一般測5分鐘~10分鐘。咀嚼刺激法將1G膠姆以每分鐘20次的頻率咀嚼10分鐘,低于10ML/10MIN為異常低下;或用5G醫(yī)用白蠟,溫水泡軟后咀嚼6分鐘,低于6ML/6MIN為異常低下。方糖法取方糖15CM15CM置于舌背上,勿動,正常情況下15分鐘~30分鐘方糖全部溶化,否則認為分泌功能低下。酸刺激法可能影響唾液的緩沖容量和PH等。,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,實驗方法3動態(tài)唾液總流率測定包括腮腺、下頜下腺與舌下腺的測定。常用測定方法包括腮腺唾液分泌測定用LASHLEY杯吸附于頰黏膜的導(dǎo)管開口處,靜止腮腺流率變異較大,而酸刺激流率低于1ML/5MIN為異常低下。下頜下腺與舌下腺唾液分泌測定因兩腺體常共同開口于口腔,所以測定分泌時常收集在一起,常用插管法和隔離法。小唾液腺唾液分泌測定通常用色層分析紙收集,擦干局部黏膜后貼于黏膜2分鐘后,用濕度儀測其含水率。,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,實驗報告與評定靜態(tài)唾液總流率或動態(tài)唾液總流率,或單個腺體分泌情況分析。思考題靜態(tài)唾液流率測定和動態(tài)唾液流率測定應(yīng)該注意些什么各應(yīng)用于何種情況下,注意事項使用咀嚼法測定唾液腺分泌時不影響唾液成分,相對比較常用,但要注意保持恒定的咀嚼頻率。單個腺體唾液收集方法較復(fù)雜,且不能反映所有唾液腺總的分泌狀況,在評價整個唾液腺功能時有局限性,不過在測定唾液成分時因污染少而多采用此方法。,第二節(jié)口腔生物化學(xué)實驗,第三節(jié)口腔疾病分子生物學(xué),實驗九以釉原蛋白基因進行性別鑒定,實驗?zāi)康呐c要求通過此實驗學(xué)會PCR檢測技術(shù),包括DNA提取、分光光度計的使用、引物設(shè)計的原則、PCR擴增的條件設(shè)定,以及電泳和測序結(jié)果分析等。實驗原理針對AMELOGENIN基因內(nèi)含子1區(qū)X染色體上6BP缺失的特性,采用一對X、Y同源引物擴增,男性個體同時得到X染色體AMELOGENIN等位基因特異性段簡稱AMX,106BP或212BP和Y染色體AMELOGENIN等位基因特異性片段簡稱AMY,112BP或218BP,分型結(jié)果表現(xiàn)出兩條譜帶;而女性僅有AMX106BP或212BP,分型表現(xiàn)為一條譜帶,因此鑒定性別。實驗內(nèi)容,第三節(jié)口腔疾病分子生物學(xué),實驗設(shè)備及器材,5ML無菌試管(含肝素抗凝劑);POWERPLEXM16SYSTEMDNA提取試劑盒,AM基因上游引物和下游引物,2TAQPCRMASTERMIX;20BPDNALADDERMARKER;DNA片段快速純化試劑盒。,實驗方法,樣品采集,采集靜脈血5ML于無菌抗凝管中,DNA提取和含量檢測,,,性別鑒定,PCR擴增、凝膠電泳、純化測序,第三節(jié)口腔疾病分子生物學(xué),實驗方法,DNA提取和含量檢測,第三節(jié)口腔疾病分子生物學(xué),實驗方法,性別鑒定PCR擴增、凝膠電泳、純化測序PCR擴增PCR反應(yīng)引物序列如下上游引物5‘CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG3’,下游引物5‘ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’;模板DNA為上述血液所獲樣品的DNA提取液。PCR反應(yīng)體系為25ΜL,其中2TAQPCRMASTERMIX125ΜL,上下游引物1ΜMOL/L各1ΜL,無菌雙蒸水95ΜL,模板DNA1ΜL。PCR反應(yīng)參數(shù)95℃預(yù)變性5分鐘;95℃變性30秒,60℃退火30秒,72℃延伸30秒,35個循環(huán);72℃延伸7分鐘。凝膠電泳制備濃度為3G/L的瓊脂糖凝膠,置1TAE電泳緩沖液中,電泳條件為電壓100V,電泳時間120分鐘。電泳結(jié)果放入凝膠成像儀中進行觀察。純化測序?qū)傊悄z上的特異性條帶切下純化、回收、測序。,第三節(jié)口腔疾病分子生物學(xué),結(jié)果分析,MMARKER;1、2陰性對照;3、5女性;4男性,實驗報告評定PCR擴增后凝膠電泳和測序結(jié)果分析評定。思考題1PCR檢測分析技術(shù)中最重要的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有哪些2PCR實驗中容易出問題的操作有哪些應(yīng)該如何避免,第三節(jié)口腔疾病分子生物學(xué),注意事項引物引物是PCR反應(yīng)的關(guān)鍵,其特異性取決于引物與模板DNA的互補程度。引物的長度最好為15BP~30BP;引物擴增跨度以200BP~500BP為宜,特定條件下可擴增長度至10KB的片段;其中GC含量以40~60為宜,ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列;避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)或兩條引物間互補,特別是3’端的互補;3’端的堿基,尤其最末及倒數(shù)第二個堿基應(yīng)嚴格要求配對;引物中有或最好加上合適的酶切位點,被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點;引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性;每條引物的濃度01ΜMOL~1ΜMOL或10PMOL~100PMOL,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好。PCR循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增的程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30次~40次之間,循環(huán)次數(shù)越多,但非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。設(shè)立對照PCR反應(yīng)應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照,它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要參考指標。,第三節(jié)口腔疾病分子生物學(xué),第四節(jié)骨組織生物學(xué)和口腔細胞培養(yǎng),實驗十成骨細胞的分離培養(yǎng),實驗?zāi)康呐c要求掌握分離、培養(yǎng)和鑒定成骨細胞方法,了解成骨細胞的功能與特性。實驗原理成骨細胞一個明顯特征是可形成礦化結(jié)節(jié),故采用VONKOSSA染色法對成骨細胞形成的礦化結(jié)節(jié)進行鑒
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