簡介：學位論文獨創(chuàng)性聲明學位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外。論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得壺昌太堂或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名掏茗F如簽字同期2爿5年√月么日學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解直墾太堂有關保留、使用學位論文的規(guī)定，有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權直昌太堂可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編本學位論文。同時授權中國科學技術信息研究所和中國學術期刊光盤版電子雜志社將本學位論文收錄到中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫和中國優(yōu)秀博碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫中全文發(fā)表，并通過網(wǎng)絡向社會公眾提供信息服務。保密的學位論文在解密后適用本授權書學位論文作者簽名手寫聊期艫Ⅲ日導師簽，‘手寫_乏獺搟R鞭山FJ每支具壚。摘要驗組分別加入蛋白質合成抑制劑放線菌酮后，WESTERNBLOT方法檢測PUMA蛋白的表達變化情況；RTPCR方法檢測PUMA及凋亡相關基因BAX、BCL．2的MRNA的表達變化；分光光度法檢測細胞的CASPASE．3活性變化。結果經(jīng)PCR及測序結果表明，正確構建野生型、突變型PUMA重組質粒，PUMA基因第10位氨基酸的第28～30位堿基由TCC突變?yōu)镚CC，其他堿基均無突變。野生型、突變型PUMA重組質粒轉染HELA細胞熒光顯微鏡觀察到綠色熒光表達。WESTERNBLOT和RTPCR均檢測出目的基因的高表達。提示PUMA基因及其定點突變載體均構建成功。在相同轉染效率的情況下，通過WESTERNBLOT分析野生型PUMA組和突變型PUMA組的表達水平，結果表明突變型PUMA蛋白比野生型PUMA蛋白有一個更高的穩(wěn)定狀態(tài)。在表達野生型和突變的PUMA細胞中我們通過實時定量PCR測量出同等量的PUMAMRNA，表明并不是由于轉染效率或不同的轉錄率導致的這種差異；接下來在轉染24H后誘導表達野生型和突變型的PUMA細胞中均加入蛋白質合成抑制劑放線菌酮，然后對PUMA蛋白的降解進行檢測，結果表明，由于我們改變了PUMA蛋白的磷酸化位點，導致突變型PUMA蛋白降解延遲、半衰期延長，提示10號位絲氨酸磷酸化在決定PUMA降解率上具有重要的作用；野生型PUMA質粒、突變型PUMA質粒分別轉染HELA細胞，在24、48小時后測定光密度值，結果發(fā)現(xiàn)細胞轉染兩種質粒后，細胞存活率隨著時間的延長逐漸下降，且轉染突變型PUMA質粒在24、48小時的存活率均比野生型PUMA質粒組低，差異有統(tǒng)計學意義PO．05，這表明突變型PUMA對HELA細胞抑制增殖作用優(yōu)于野生型PUMA；通過PI及HOECHST33342染色后評價細胞核型，計算被轉染細胞中的早期和晚期凋亡細胞數(shù)。轉染24H后，轉染突變型PUMA組在GFP陽性細胞中有22．5％的細胞出現(xiàn)凋亡，空載體組只有11．8％，相比轉染野生型PUMA組細胞中增加了約9．2％的細胞凋亡，差異有統(tǒng)計學意義PO．05。而隨著轉染PUMA在細胞中表達時間的延長，48H后突變型PUMA組比轉染野生型PUMA組細胞凋亡增加了約9．5％，差異有統(tǒng)計學意義PO．05。流式細胞術結果發(fā)現(xiàn)，隨著PUMA轉染時間的增加，野生型和突變型兩組腫瘤細胞的凋亡率均逐漸升高，并且突變型組細胞比野生型組細胞的凋亡率增加更加明顯，這與核染色結果相似。轉染突變型PUMA質粒作用HELA細胞，在0、6、12、24、36、48小時，

簡介：分類號密級國際十進分類號（UDC）第四軍醫(yī)大學學位論文大鼠肝干細胞和肝癌干細胞間生物學特性差異分析及相關分子調控機制研究（題名和副題名）劉衛(wèi)輝（作者姓名）指導教師姓名竇科峰教授（主任醫(yī)師）指導教師單位第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院肝膽胰脾外科申請學位級別博士專業(yè)名稱外科學（普外）論文提交日期201204答辯日期201205論文起止時間2009年09月至2012年05月學位授予單位第四軍醫(yī)大學大鼠肝干細胞和肝癌干細胞間生物學特性差異分析及相關分子調控機制研究大鼠肝干細胞和肝癌干細胞間生物學特性差異分析及相關分子調控機制研究研究生劉衛(wèi)輝學科專業(yè)外科學（普外）所在單位第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院肝膽胰脾外科導師竇科峰教授（主任醫(yī)師）輔導教師陶開山教授（主任醫(yī)師）資助基金項目國家自然科學基金重點項目（81030010）國家自然科學基金面上項目（81170419）國家自然科學基金面上項目（81172061）國家自然科學基金面上項目（30772102）國家自然科學基金面上項目（30772094）關鍵詞肝干細胞；肝癌干細胞；生物學特性；正常分化；分化受阻；惡性轉化；小分子RNAS。中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學二O一二年四月

簡介：目的血管損傷部位新生內膜的形成是動脈粥樣硬化AS和血管成形術后再狹窄PTCA病理過程中的重要事件之一，當血管內膜受損時，位于血管中膜的血管平滑肌細胞VSMC在生長因子和細胞因子的刺激下由收縮表型轉化為合成表型，并獲得向內膜下遷移、增殖及合成和分泌大量細胞外基質ECM的能力。VSMC遷移主要是由ECM蛋白和細胞表面整合素受體主要是ΑVΒ3相互作用所介導的。已經(jīng)證明，在各種ECM蛋白中，骨橋蛋白OPN與細胞遷移和黏附的關系最為密切。OPN通過它所含有的RGD序列與整合素ΑVΒ3、ΑVΒ5相互作用，通過SVVYGLR序列與整合素Α9Β1、Α4Β1結合。已經(jīng)證實，含RGD和SVVYGLR序列的短肽能夠競爭性的抑制OPN與多種整合素的結合，從而抑制VSMC以及炎性細胞的黏附和遷移。以小分子肽作為阻斷劑研究蛋白質的功能是揭示細胞活動調節(jié)機制的重要手段。本實驗利用基因重組技術，將含有編碼RGD序列的CDNA片段與攜帶2HISTRXSTAG編碼序列的原核表達載體PET32C重組，構建PET32CRGD重組子，將其轉化大腸桿菌BL21DE3，表達產(chǎn)物為HISTRXSTAGRGD融合蛋白簡稱HISRGD。經(jīng)分離純化后獲得HISRGD純品，該短肽可作為阻斷劑用于研究OPN在體內的生物學作用。方法1重組表達質粒的構建與鑒定將編碼RGD13肽的DNA以下簡稱RGD片段經(jīng)NCOIBAMHI酶切位點克隆入PET32C載體，構建HISRGD融合蛋白表達質粒。通過雙酶切和序列分析對重組質粒進行鑒定。2HISRGD融合蛋白在大腸桿菌中的表達21HISRGD融合蛋白的誘導表達將PET32CRGD轉化大腸桿菌BL21DE3，在不同條件下，用IPTG誘導后可檢測HISRGD融合蛋白的表達活性，并對IPTG濃度、誘導時間和誘導溫度進行篩選優(yōu)化，確定HISRGD融合蛋白誘導表達的最佳條件。表達產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE檢查融合蛋白在細胞中的存在形式。22HISRGD融合蛋白的分離純化取含有表達產(chǎn)物的細菌裂解液上清直接經(jīng)NINTAHISBINDRESIN金屬離子螯合層析進行純化。3HISRGD融合蛋白生物學活性檢測31黏附抑制實驗取34代體外培養(yǎng)的VSMC分別與0、150、300、450MGL的HISRGD融合蛋白預孵育1H，然后將細胞接種到用BSA20MGL或OPN20MGL包被的96孔板中，檢測單位時間2H內黏附至孔板上的細胞數(shù)，以此表示細胞黏附活性。以融合蛋白洗脫液和2HISTRXSTAG蛋白作為平行對照，以確定HISRGD抑制細胞黏附的特異性。32傷口愈合實驗將VSMC接種于帶有玻片的孔板內，待細胞生長至100％匯合后，分別加入0、150、300、450MGL的HISRGD預孵育1H。取出玻片，用無菌吸頭在玻片上劃痕。隨即將玻片放回孔板內，每孔加入20MGLOPN或20MGLBSA100ΜL，繼續(xù)孵育24H后，于低倍鏡下觀察細胞傷口愈合程度，以此表示細胞的遷移活性。以融合蛋白洗脫液和2HISTRXSTAG蛋白作為平行對照，以確定HISRGD抑制細胞遷移的特異性。結果1重組表達質粒PET32CRGD的構建與鑒定重組表達質粒經(jīng)NCOI和BAMHI雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳鑒定時出現(xiàn)長度為50BP的插入片段，與預期結果相一致。測序結果顯示插入片段的核酸序列正確無誤。重組質粒命名為PET32CRGD。2HISRGD融合蛋白的誘導表達轉化PET32CRGD的宿主菌經(jīng)IPTG誘導后可表達約1871KD的蛋白質，與HISRGD融合蛋白分子量相一致，該融合蛋白主要以可溶性蛋白形式存在于胞漿。取培養(yǎng)物OD60006按150接種于含001MMOLLIPTG的LB培養(yǎng)液中，25℃誘導培養(yǎng)7H時，HISRGD融合蛋白的表達量最大，此條件作為HISRGD融合蛋白誘導表達的最佳條件。3HISRGD融合蛋白的純化經(jīng)NINTAHISBINDRESIN金屬離子螯合層析進行純化后，每100ML培養(yǎng)物可得到約25MG電泳純的可溶性HISRGD融合蛋白，純度為95％。4HISRGD融合蛋白對細胞黏附的影響?zhàn)じ揭种茖嶒灲Y果顯示，在所觀察的濃度范圍內，HISRGD融合蛋白能劑量依賴性的抑制VSMC在OPN包被板上的黏附，在融合蛋白為450MGL時，抑制效果最明顯。5HISRGD融合蛋白對細胞遷移的影響傷口愈合實驗結果表明，HISRGD能劑量依賴性的抑制VSMC遷移，在融合蛋白為450MGL時，抑制效果最明顯。結論1成功構建了含有OPNRGD序列13肽基因單拷貝的PET32CRGD原核表達質粒。2經(jīng)過對IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間等條件進行優(yōu)化，HISRGD融合蛋白在大腸桿菌中得到有效表達。3每100ML培養(yǎng)物經(jīng)親和層析純化可得到約25MG電泳純的可溶性融合蛋白，純度為95％。4HISRGD融合蛋白能夠劑量依賴性的抑制OPN誘導的VSMC的黏附與遷移。

簡介：在腫瘤血管生成過程中，活化血管內皮細胞整合素表達明顯上調。精氨酸甘氨酸天冬氨酸（RGD）三肽序列能夠特異性識別整合素ΑVΒ3，構建含RGD肽的高特異性MR探針對腫瘤血管生成進行分子成像，可以達到早期診斷，評估治療效果及預測預后的目的。本項研究制備了RGD肽標記的以聚乳酸（PLA）為包被材料的超小超順磁性氧化鐵（USPIO）以RGDPLAUSPIO指代，并在體外和體內實驗中考察了其檢測腫瘤血管生成的能力。此外，本研究探討了檸檬酸和右旋糖酐包被的磁性納米粒子標記臍靜脈血管內皮細胞（HUVECS）后，對其增殖、遷移、侵襲、分化等生物學行為的影響。具體研究內容主要包括以下四個部分第一部分采用改良共沉淀法（乙醇水溶液為溶劑的超聲共沉淀法）制備PLAUSPIO，以透射電鏡TEM和傅里葉變換紅外光譜FTIR表征，顯示經(jīng)PLA包覆的USPIO呈球形結構，且表面富有羧基，為進一步偶聯(lián)配體或其他靶分子提供了條件。PLAUSPIO具有較好的弛豫效能，在T2和T2圖像可以呈現(xiàn)明顯的信號改變。將PLAUSPIO靜脈注射后，可以有效的減少網(wǎng)狀巨噬細胞系統(tǒng)（RES）對USPIO的攝取，延長在血液循環(huán)中停留的時間。通過計算USPIO注射前后T2和T2弛豫時間改變，發(fā)現(xiàn)T2WI和T2值的測量對USPIO引起的磁場不均一更為敏感。第二部分將RGD與PLAUSPIO經(jīng)CROSSLINK反應偶聯(lián)制備RGDPLAUSPIO探針。RGDPLAUSPIO與B16F10、SPCAL和HUVECS的結合實驗證明，探針與整合素特異性結合的能力，并且其結合的多少與細胞表達整合素水平高低相關。透射電鏡結果進一步證實了細胞內納米氧化鐵顆粒的存在。RGDPLAUSPIO與HUVECS孵育后行MR掃描顯示濃度相關性T2WI信號降低，提示RGDPLAUSPIO作為對比劑所構建的MR探針具有應用于MR成像的可能性。第三部分VX2腫瘤惡性度高，病理組織學證實腫瘤內小血管ΑVΒ3整合素表達強陽性，是研究腫瘤血管生成的理想模型。將體外實驗驗證后的RGDPLAUSPIO探針在VX2腫瘤進行活體成像，以PLAUSPIO作為對照，結果表明RGDPLAUSPIO可特異性降低VX2腫瘤組織T2WI和T2WI信號強度，在腫瘤周邊富血管區(qū)域呈點片狀信號降低。注射RGDPLAUSPIO前后的T2和T2弛豫時間變化量與PLAUSPIO相比有明顯差異，且以T2值的變化更為敏感。普魯士藍染色證明腫瘤血管內皮細胞見藍色鐵顆粒存在，病理學結果與MR圖像得到相互印證。以上結果提示RGDPLAUSPIO有望成為針對腫瘤血管生成的特異性MR探針。第四部分在細胞水平研究了檸檬酸和右旋糖酐包被的氧化鐵納米粒子對HUVEC細胞增殖、遷移、侵襲、分化能力的影響，觀察了細胞骨架結構的改變。結果顯示兩種不同包被包被材料的氧化鐵納米粒子均可以抑制HUVECS增殖、遷移和侵襲，這種抑制能力呈濃度依賴性，且檸檬酸包被的氧化鐵納米粒子較右旋糖酐包被的氧化鐵納米粒子具有更高的細胞毒性。氧化鐵納米粒子可以顯著遏制內皮細胞分化成管腔樣結構的能力，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞骨架重新分布，粘著斑形成減少，細胞粘附能力減弱。由于細胞的粘附是貼壁細胞存活、生長、遷移、侵襲、分化等其他一切細胞生物活動的基礎，經(jīng)氧化鐵納米粒子處理后細胞出現(xiàn)的去粘附造成了其增殖、遷移、侵襲、分化能力的障礙。這種障礙很可能與鐵催化的自由基損傷反應相關?？偨Y以上實驗，本研究成功構建以整合素ΑVΒ3為分子靶的特異性MR探針RGDPLAUSPIO，結果表明RGDPLAUSPIO可以有效在MR圖像上顯示活化腫瘤血管內皮整合素ΑVΒ3的表達。HUVECS與檸檬酸或右旋糖酐包被的氧化鐵納米粒子孵育后，細胞的增殖、遷移、侵襲和分化能力等均受到不同程度的抑制。

簡介：非酒精性脂肪性肝?。∟ONALCOHOLICFATTYLIVERDISEASE，NAFLD）是一種肝組織病理學改變與酒精性肝病相類似但無過量飲酒史的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化在內的一組臨床病理狀態(tài)。近20年來，該病已成為許多發(fā)達和發(fā)展中國家日益增多而日顯重要的疾病。在美國，NAFLD已成為慢性肝病的最主要原因，美國成人中患病率達10％～24％，歐洲及日本的情況與此相似；而在我國，隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，其發(fā)病率在一些大中城市也逐漸上升，其中上海約154％，已成為繼病毒性肝炎之后的第二大肝病。雖然單純的肝脂肪變預后良好，但部分患者仍具有進展為脂肪性肝炎、肝纖維化、甚至肝硬化和肝癌的潛在危險，且其與肥胖、糖尿病、高脂血癥、高血壓等疾病密切相關，故NAFLD已被認為是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)。代謝綜合征是一系列以胰島素抵抗為中心的疾病的集結體，代謝綜合征的重要意義在于其和心血管疾病和糖尿病的預后相關。肝臟作為能量代謝的重要器官，其發(fā)生脂肪變，既可以是胰島素抵抗的結果，又可由此加重代謝紊亂而誘發(fā)和加劇胰島素抵抗。故對其機制的闡明，改善其功能狀態(tài)，將有助于代謝綜合征的防治。而在臨床上，我們也經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)，NAFLD常與膽石癥主要為膽固醇結石伴發(fā)，且一些流行病學的研究也發(fā)現(xiàn)NAFLD患者的膽石癥患病率高于普通人群。新近關于代謝綜合征的研究發(fā)現(xiàn)NAFLD和膽石癥均是代謝綜合征的表現(xiàn)，因為兩者均具有高胰島素血癥即“胰島素抵抗”這一代謝綜合征的中心環(huán)節(jié)。我們的研究將以NAFLD伴膽石癥患者為主要研究對象，通過一些臨床表現(xiàn)中所觀察到的相關性變化，進一步從分子學水平來探索NAFLD的發(fā)病機制，以為代謝綜合征的綜合防治尋找新的線索和潛在的治療靶點。第一部分、非酒精性脂肪性肝病伴膽囊膽固醇結石病的臨床與病理學研究目的比較分析NAFLD伴膽囊膽固醇結石病患者與單純膽石癥患者的臨床表現(xiàn)與特點；并探尋NAFLD伴膽石癥患者血液生化指標與肝臟病理學改變的關系。方法應用影像學和肝臟病理學檢查將50名研究對象分為NAFLD伴膽石癥組、單純膽石癥組和正常對照組。對各組患者進行肝、腎功能、血脂、血糖、胰島素、C肽等血清生化檢測。對NAFLD伴膽石癥患者的肝組織作HE和MASSON染色。統(tǒng)計分析各組患者臨床特征和血生化指標的差異，并對NAFLD伴膽石癥患者血液生化指標與肝臟病理學檢測作相關性分析。結果NAFLD伴膽石癥患者具有較明顯的代謝紊亂狀況，單純膽石癥組也存在TG和膽汁酸代謝紊亂。該兩組患者HOMAIR明顯高于正常對照組。在那些具高TG血癥的NAFLD伴膽石癥患者中發(fā)現(xiàn)TG與肝臟脂肪變呈正相關（R0389，P005），與纖維化呈負相關（R0394，P005）但與炎癥程度無相關性。而LDLC與肝纖維化程度呈正相關（R0437，P001），與肝內脂肪變和炎癥程度無相關性。HDLC與肝內脂肪變程度呈負相關（R0357，P005），與炎癥程度呈負相關（R0362，P005）并與纖維化程度呈負相關（R0425，P001）。結論NAFLD伴膽石癥患者具有較明顯的脂代謝紊亂狀況，并具有心血管事件的高危因素。血漿膽固醇相關指標可能為NAFLD患者肝內纖維化的預測因子。第二部分、FXR、SREBPS等在NAFLD伴膽囊膽固醇結石形成中的作用目的探討FXR、SREBPS等因子在NAFLD伴膽石癥及膽石癥發(fā)病機制中的作用與關聯(lián)。方法病人分組情況同第一部分，采用RTPCR法比較NAFLD伴膽石癥、單純膽石癥和正常對照組患者肝組織中FXR、SREBP1C、SREBP2、HMGCR、PGC1ΑMRNA表達的差異；免疫組化法觀察三組患者肝組織切片中FXR、SREBP1C的表達情況。結果與正常對照組相比，NAFLD伴膽石癥組患者肝組織SREBP1C、HMGCRMRNA的表達上調（P001），F(xiàn)XR、PGC1ΑMRNA表達下降（P001）；單純膽石癥組僅有HMGCRMRNA的表達上調（P005）和PGC1ΑMRNA表達下降（P001）。免疫組化染色顯示NAFLD伴膽石癥患者FXR表達明顯下降（P001），而SREBP1C表達明顯增多（P001）。結論脂代謝及膽汁酸代謝相關基因可能在NAFLD伴膽石癥及膽石癥發(fā)病中具有一定作用，F(xiàn)XR可能是代謝綜合征相關疾病的中間聯(lián)結點。

簡介：蘇州大學博士學位論文CD40分子在人宮頸癌組織中表達的臨床意義及CD40信號對宮頸癌細胞株SIHA體外的生物學效應姓名黃沁申請學位級別博士專業(yè)普外科學指導教師錢海鑫張學光20080501CIM0分子在人宮頸癌組織中表達的臨床意義及CIMO信號對宮頸癌細胞株SIHA體外的生物學效應中文摘要相關性。宮頸癌組織中HPVL6／18E6、P16嗍8、VEGF分子表達均較正常組織高786％、8036％、8750％。CD34MVD在宮頸癌組織上表達為27。02士1068，明顯較其它各組增高P0001。HPVL6／18E6陽性表達的宮頸CINIIHI組織中，P16玳K48表達陽性者占9047％，HPVL6／18一E6陽性表達的宮頸癌組織中，P16ⅨK43表達陽性達9772％，因此P16礬K44在宮頸CINIIILL及宮頸癌中的表達和HPVL6／18E6的陽性表達有明顯的相關性R0362，P005；R0837，P001。CD40分子的表達和P16帳4的表達呈正相關RO52，PO01；和HPVL6／18E6、VEGF以及CD34MVD的表達亦有一定的正相關性，057，POOL；RO32，PO05；RO37，PO05。結論CD40可作為宮頸癌診斷、預后和淋巴結轉移評估的客觀指標。CD40分子表達與抑癌基因P16礬“8、HPVL6／18E6以及VEGF和CD34MVD的表達有一定的正相關性，由此提示CD40分子在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起著非常重要的作用。二、激發(fā)型CD40單抗對宮頸癌細胞株體外增殖和化學藥物敏感性的作用目的研究CD40分子激發(fā)對宮頸癌細胞SIHA化療敏感性的影響及其機制。方法采用流式細胞術檢測宮頸癌細胞SIHA上CD40分子的表達，MTT法檢測CD40單抗5C11聯(lián)合化療藥物對SIHA細胞的作用，PI染色檢測SIHA細胞周期的變化，ANNEXINV二PI法檢測細胞凋亡、REALTIMEPCR方法分析單抗5CLL作用SIHA細胞后凋亡基因表達水平變化。結果宮頸癌SIHA細胞表面CD40表達率為960％，SIHA細胞經(jīng)5CLL作用后出現(xiàn)G2／M期阻滯，5CLL和化療藥物鹽酸吉西他濱GEMCITABIN各自抑制細胞生長作用不明顯，但兩者聯(lián)合能顯著抑制SIHA的生長和促進凋亡。SIHA細胞在和5CLL作用24小時后，抗調亡基因BCLXL的表達明顯下調，促調亡基因BAX的上調作用不明顯。結論CD40分子通過介導G2／M期阻滯和調節(jié)凋亡基因表達水平增加SIHA細胞對腫瘤化療藥物鹽酸吉西他濱敏感性。【關鍵詞】CD40宮頸癌；免疫組織化學單克隆抗體；化療敏感性Ⅱ作者黃沁指導教師錢海鑫張學光

簡介：山東大學博士學位論文影響肝細胞性肝癌轉移和復發(fā)的相關分子生物學研究姓名滕木儉申請學位級別博士專業(yè)外科學（普外）指導教師李兆亭2002429●■山爾大學博七論文異倍體腫瘤1L例324％；異倍體腫瘤伴轉移和門靜脈侵犯為634％7／11，而二倍體瘤為174％4／23，兩者差異顯著PO01腫瘤DNA二倍體或異倍體與腫瘤大小、HBV感染、AFP定量無明顯相關，但低分化癌中異倍體所占比例較高。KI一67抗原在HCC中呈現(xiàn)高表達，KI～67在HCC中呈1423658表達，在肝硬化組織中較低，為452231，在HCC中表達明顯增加，與肝硬化組織相比差異顯著P001；KI一67抗原，在HCC伴門靜脈癌栓、肝內轉移者陽性與不伴有者陰性相比差異顯著P‘O05，在低分化腫瘤中也表達較高，但KI一67抗原表達強度與腫瘤大小、AFP水平等因素無明顯相關性與HCC肝內轉移和門靜脈癌栓明顯相關P005；KI一67表達和端粒酶活性及肝癌異倍體腫瘤與肝細胞肝癌肝內轉移、門靜脈癌栓等因素的關系極為相似。結論大多數(shù)HCC肝組織端粒酶活性呈現(xiàn)陽性表達，僅個別肝硬化組織端粒酶活性呈現(xiàn)弱陽性，HCC肝組織端粒酶活性呈現(xiàn)陽性表達者侵襲性明顯增強；KI一67在HCC中呈現(xiàn)高表達，與肝癌細胞增生活躍程度和侵襲力呈幣相關HCC異倍體腫瘤較二倍體浸潤能力為強；肝癌細胞端粒酶活性呈現(xiàn)陽性、KI67基因陽性表達和DNA異倍體腫瘤與肝癌肝內轉移、門靜脈癌栓密切相關，其在腫瘤發(fā)生、轉移及預后中起著重要作用，尤其端粒酶可做為臨床滲斷、惡性程度及預后判斷67基因和DNA倍體等檢測臨床價值更加突出。關鍵詞肝細胞性羅端弋歲DNA含量KI吵I。、；鏊

簡介：目的探討臨床相關毛孢子菌對5種常見抗真菌藥物的體外敏感性；研究聯(lián)合應用PCR反向線點雜交技術鑒定臨床常見毛孢子菌。方法首先對48株毛孢子菌通過形態(tài)學、API20CAUX、VITEK2COMPACT進行初步鑒定，然后測序核糖體RDNAITS、28SD1D2區(qū)準確鑒定到種；對36株阿薩希毛孢子菌核糖體RDNA28S和5S之間的IGS1區(qū)進行測序并基因分型，作分子流行病學分析；采用濃度梯度法ETEST測定氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B及卡泊芬凈對48株毛孢子菌的最低抑菌濃度MIC；基于不同種毛孢子菌RDNAITS或D1D2區(qū)序列多形性設計種特異性探針，評價反向線點雜交技術對常見毛孢子菌的區(qū)分能力。結果形態(tài)學方法不能準確區(qū)分不同種的毛孢子菌，生化鑒定法，如API20CAUX或VITEK2COMPACT只能鑒定阿薩希毛孢子菌、粘質毛孢子菌及皮瘤毛孢子菌，對這3種之外的其他毛孢子菌無法鑒定。聯(lián)合應用核糖體RDNAITS及D1D2區(qū)序列分析將48株毛孢子菌鑒定為8個種36株阿薩希毛孢子菌TRICHOSPONASAHII、1株皮瘤毛孢子菌TINKIN、1株真皮毛孢子菌TDERMATIS、1株皮膚毛孢子菌TCUTANEUM、1株賴巴克毛孢子菌TLAIBACHII、2株TJAPONICUM、4株TDOMESTICUM和2株TJIROVECII。IGS1區(qū)序列分析結果顯示35株阿薩希毛孢子菌菌株PUMCH30418沒參加分析共有四種基因型，分別為GENOTYPE1，3，4，6，所占比例分別為286％、20％、485％、29％；報道稱日本菌株主要為GENOTYPE1，美國菌株為GENOTYPE3或5。體外藥敏結果顯示氟康唑和兩性霉素B對阿薩希毛孢子菌活性很差MIC50分別為24ΜGML和2ΜGML，MIC90分別為256ΜGML和64ΜGML；除一株真皮毛孢子菌TDERMATIS對伏立康唑有較高MIC值外，伏立康唑和伊曲康唑對不同種毛孢子菌有很好的體外活性；新型抗真菌藥卡泊芬凈對毛孢子菌幾乎無體外活性，除一株皮膚毛孢子菌TCUTANEUM外，其他47株毛孢子菌MIC32ΜGML。反向線點雜交的結果通過對8種毛孢子菌核糖體RDNAITS及D1D2區(qū)序列多形性分析，共設計了34個種特異性探針；所有探針具有相同的參數(shù)，長度1830BP，TM值5865℃，二級結構不超過中級，不形成二聚體等；從DNA提取到反向線點雜交結果觀察歷時10多個小時，以測序鑒定結果為標準，反向線點雜交技術成功地將8種毛孢子菌區(qū)分開來。結論形態(tài)學方法不論是菌落形態(tài)還是顯微鏡下特點都不足以區(qū)分不同種的毛孢子菌；生化鑒定法常常對少見真菌無能為力，本研究中API20CAUX或VITEK2COMPACT只能鑒定阿薩希毛孢子菌、粘質毛孢子菌及皮瘤毛孢子菌；DNA序列分析，特別是聯(lián)合核糖體RDNAITS及D1D2區(qū)序列分析可快速準確地區(qū)分不同種毛孢子菌；反向線點雜交技術基于RDNAITS及D1D2區(qū)序列多形性設計種特異性探針，經(jīng)簡單的反向線點雜交步驟成功地將8種毛孢子菌鑒定開來，是一種耗時短、操作簡便、特異性良好的分子生物學鑒定及診斷方法；毛孢子菌對5種常見抗真菌藥物的敏感性不同于常見酵母菌，且不同種毛孢子菌之間的敏感性也有很大差異。本研究與文獻中的結論相同，兩性霉素B和氟康唑對阿薩希毛孢子菌的體外活性較差，卡泊芬凈對毛孢子菌沒有體外抗菌活性；三唑類抗真菌藥物伏立康唑和伊曲康唑對毛孢子菌的體外敏感性最好。所以對臨床分離得到的毛孢子菌準確鑒定到種并進行體外藥敏試驗對指導臨床采取合理的治療措施具有非常重要的意義。

簡介：蘇州大學碩士學位論文鼠抗人41BBL分子功能性單克隆抗體的研制及其生物學特性的研究姓名居頌文申請學位級別碩士專業(yè)免疫學指導教師張學光邱玉華20030501鼠抗人41BBL分子功能性單克隆抗體的研制及其生物學特性的研究中文摘要為陽性細胞株，以轉基因細胞的母本細胞XGL作為陰性對照細胞株，經(jīng)免疫熒光標記分析及抗體分泌陽性孔內細胞的反復篩選并經(jīng)多次的克隆化培養(yǎng)，最終獲得1株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人41BBL單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為1F1。經(jīng)快速定性試紙分析法鑒定，它分泌的IG類別為IGGL。經(jīng)體外長期傳代培養(yǎng)和液氮凍存后復蘇，雜交瘤細胞生長良好，分泌抗體的性能穩(wěn)定。2繼而采用本室建立的腹水誘生和純化方案，腹水形成的陽性率為95％，腹水的產(chǎn)量平均為75ML／只小鼠。經(jīng)PROTEING親和層析法純化抗體，純化后腹水MAB蛋白的平均得率為350MEDML。免疫熒光法分析表明，純化后腹水型單抗的效價為12000以上，純化后抗體蛋白用于間接免疫熒光分析的用量為025～20LAG／1X106細胞。3為了研究單克隆抗體對41BBL分子表達細胞的識別和結合，選擇表達4IBBL膜分子的SUPT、JURKAT、HEPG2、RAJI、DAUDI、HL60、U266和新鮮分離的單核細胞通過間接免疫熒光標記法及流式細胞儀FCM分析，結果顯示，單克隆抗體IFL能特異性的識別不同細胞表達的41BBL分子。4進一步中和／阻斷實驗中表明，IFL能特異性阻斷RH41BBL分子介導的協(xié)同刺激信號，從而抑制RH41BBL聯(lián)合CD3激發(fā)型單抗對人外周血T淋巴細胞的增殖激發(fā)效應。5經(jīng)過3HTDR摻入法、細胞記數(shù)、光鏡觀察及FCM分析證實1F1能介導逆向共刺激信號促進表達4BBL的人外周血來源的單核細胞增殖3～9倍，其作用明顯強于RH41BB對單核細胞促增殖效應。經(jīng)1FI誘導擴增的單核細胞，經(jīng)GMCSF、IL4、N師一。誘導培養(yǎng)后能分化發(fā)育成樹突狀細胞DCS初步分析證實該誘導的DCS不論在表型還是在激發(fā)T細胞的功能較常規(guī)方法誘導的DCS無顯著差異。同時我們還發(fā)現(xiàn)1F1也能促進DCS的增殖，提示IFL有可能成為一種更有效的體外培養(yǎng)大量單核細胞及DCS的誘導劑，在腫瘤免疫治療中具有潛在的臨床應用價值。更令人感興趣的是IFL能取代GMCSF聯(lián)合IL4誘導單核細胞分化發(fā)育成DCS。41BBL的信號傳導通路及單核細胞、DCS的分化發(fā)育的機制至今尚不明確，值得進一步探討。同時運用MAB1F1我們還發(fā)現(xiàn)，41BBL分子特征性表達于M4、M5白血病新鮮標本細胞上，而且MABIFLL～10LTG／MI時，即可促進天然表達41BBL分子的單核細胞來源的腫瘤胞株HL60、SHI1MS型白血病細胞株及M5白血病新鮮標本細胞N

簡介：第一軍醫(yī)大學博士學位論文胃癌耐藥細胞的生物學特性及凋亡相關分子的表達姓名王少東申請學位級別博士專業(yè)內科學（消化專業(yè)）指導教師周殿元張振書200261MDRPGPVCRADMMULTIDRUGRESISTANC多藥耐藥性PGLYCOPROTEINVINCRISTIRLEADRIAMYCINP一糖蛋白長春新堿阿霉素I墼壁塑墮4

簡介：家蠶BOMBYXMILINAEUS是我國的重要經(jīng)濟昆蟲與此同時家蠶又是一種重要的昆蟲致敏原。家蠶蠶蛹在傳統(tǒng)中醫(yī)中作為一種藥物被用來治療高血壓和脂肪肝中國人有食蠶蛹的習慣有關食用蠶蛹引發(fā)過敏的病例也時有報道因此在中國蠶蛹是一種重要的食物過敏原。本文旨在對家蠶蠶蛹的過敏原進行研究。1家蠶蠶蛹過敏原的SDSPAGE和免疫印跡分析首先利用超速離心法提取家蠶蠶蛹的總蛋白用12％的SDSPAGE對蛋白粗提液進行分離之后分別用11份家蠶蠶蛹過敏病人的血清與蛋白進行IGE結合測試。結果發(fā)現(xiàn)家蠶蠶蛹的蛋白有10多條蛋白質條帶其中在25KDA附近3條為主帶。在與11份患者血清的反應中共檢測到分子量近似為28、35、37、65、90KDA的陽性蛋白條帶。其中28、35、37、65KDA處的蛋白條帶與血清的陽性反應率達到了100％。提示家蠶蠶蛹中確實存在著特定的過敏原蛋白。2家蠶蠶蛹過敏原的蛋白質組學研究本部分實驗目的是通過雙向電泳、免疫印跡、質譜的方法對家蠶蠶蛹過敏原有更明確的研究。首先用雙向電泳對家蠶蠶蛹蛋白進行分離構建較為完整的家蠶蠶蛹蛋白雙向電泳圖譜；接著利用免疫印跡方法使電轉印到膜上的蛋白與陽性家蠶蠶蛹過敏患者混合血清進行反應對于能夠與過敏病人血清中IGE結合的蛋白進行質譜鑒定。實驗結果顯示家蠶蠶蛹蛋白在雙向電泳中被成功分離共得到288個蛋白點。在免疫印跡實驗中共有13個蛋白點可以與家蠶蠶蛹過敏病人血清發(fā)生陽性反應而在陰性對照中未見其發(fā)生陽性反應；對這13個陽性點進行質譜鑒定后發(fā)現(xiàn)它們分別屬于6類不同的蛋白卵黃原蛋白、30K家族蛋白、幾丁質酶、丙糖磷酸鹽異構酶、熱休克蛋白208和家蠶血液胰凝乳蛋白酶抑制劑。3家蠶蠶蛹過敏原蛋白幾丁質酶原核表達載體的構建。本部分實驗目的在于構建家蠶蠶蛹幾丁質酶原核表達載體。提取家蠶蠶蛹RNA并反轉錄得到CDNA利用設計好的PCR引物通過RTPCR得到幾丁質酶的基因片段并將其與載體PET28A連接構建表達載體。結果顯示通過RTPCR得到的幾丁質酶的基因片段的核酸序列與數(shù)據(jù)庫中的序列吻合成功構建家蠶蠶蛹幾丁質酶原核表達載體。為家蠶蠶蛹過敏原幾丁質酶的重組表達和免疫活性鑒定奠定了基礎。4家蠶蠶蛹過敏原蛋白熱休克蛋白208的克隆、表達、純化與免疫學活性鑒定通過分子生物學的方法得到的重組過敏原蛋白可以被應用于過敏診斷和免疫治療。本部分實驗目的在于得到具有免疫學活性的熱休克蛋白208重組蛋白。提取家蠶蠶蛹RNA并反轉錄得到CDNA利用設計好的PCR引物通過RTPCR得到熱休克蛋白的基因片段并將其與載體PET28A連接構建表達載體。進一步通過IPTG誘導得到熱休克蛋白的重組蛋白用NI2親和層析柱進行分離將得到的蛋白與家蠶蠶蛹過敏病人血清反應以檢測其免疫學活性。結果顯示通過RTPCR得到的熱休克蛋白的基因片段的核酸序列與數(shù)據(jù)庫中的序列吻合；通過構建表達載體和IPTG誘導得到了重組的熱休克蛋白208且其具有免疫學活性。通過本系列研究鑒定了家蠶蠶蛹總蛋白中的致敏組分建立了其蛋白質組學雙向電泳圖譜及雙向電泳免疫印跡圖譜成功地建立其過敏原幾丁質酶原核表達載體并對過敏原熱休克蛋白208進行了克隆、表達、純化和免疫學鑒定為家蠶蠶蛹的蛋白質組學、分子生物學的基礎研究奠定了堅實的基礎同時為家蠶蠶蛹過敏性疾病的特異性診斷及治療提供了理論依據(jù)。

簡介：單位代碼10222學號09863026分類號佳木斯大學臨床醫(yī)學碩士專業(yè)學位論文臨床醫(yī)學碩士專業(yè)學位論文論文題目替比夫定對HEPG2腫瘤干細胞標記分子CD133、AFP的影響及其生物學意義的研究研究生姓名王立巍學科、專業(yè)內科學導師姓名、職稱艾迎春教授論文答辯日期2012年6月9日學術誠信承諾本人鄭重聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含為獲得佳木斯大學或其他教育機構的學位或證書所使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中做了明確的說明并表示了謝意。簽名___________日期____________關于論文使用授權的說明關于論文使用授權的說明本人完全了解佳木斯大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即學校有權保留送交論文的復印件，允許論文被查閱和借閱；學校可以公布論文的全部或部分內容，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文。（保密的論文在解密后應遵循此規(guī)定）（保密的論文在解密后應遵循此規(guī)定）簽名___________導師簽名___________日期____________目錄

簡介：華中科技大學博士學位論文人乳頭瘤病毒導致子宮頸癌的分子生物學機制及其在免疫治療方面的應用研究姓名徐茜申請學位級別博士專業(yè)婦產(chǎn)科學指導教師馬丁20060301華中科技大學同濟醫(yī)學院博士畢業(yè)論文ABSTRACTOBJECTIVETOCONSTRUCTTHEBACULOVIRUSEXPRESSIONVECTORFORHUMANPAPILOMAVIRUSTYPE16L1GENEANDTRANSFORMTHEBACMIDTOINSECTSF9CELL1INETOEXPRESSHPVI6L1VIRUSLIKEPARTICALS．METHODSTHEHPV～16L1GENEWASAMPLIFLEDBYPCRANDCLONEDINTOPLASMIDPFASTHTB，ANDTHECOMBINANTPLASMIDPFASTHTBHPVL6L1WASTRANSFORMEDTOCOMPETENTCELISDHIOBAC．ATRANSFORMANTCONTAININGTHETARGETGENEWASOBTAINEDANDNAMEDASBACMIDHPVL6L1．A11THECLONINGSTEPSWEREELECTROPHORESEDINEBSTAINED1％AGAROSEGEL．AFTERTRANSFECTINGTHISTRANSFORMANTINTOSF9CELLS．ITSEXPRESSIONINSF9CELLSWASDETECTEDBYSDS～PAGEANDELECTRONMICROSCOPY．RESULTSTHEEXPERIMENTALRESULTSSHOWEDTHATTHERECOMBINANTBUCULOVIRUSWASOBTAINEDANDTHETRANSFORMANTBACMIDHPVL6LLVIRUSLIKEPARTICALSWEREEXPRESSEDININSECTSF9CELLS，THISRECOMBINANTTRANSFORMANTCANBEUSEDASTHEPROTEINACCESSEDHIGHBIOLOGICALEHARAETERISTICSFORTHEFUNCTIONALSTUDYONBACMIDHPVL6LIVIRUSLIKEPARTICALS．KEYWORDSHUMANPAPILLOMAVIRUSTYPE16VIRUSLIKEPARTICALSRACEINE高危型人乳頭瘤病毒HPV如16、18、33、31、58型感染是是富頸癌發(fā)生的主要致病因素，其中HPVL6型感染又占其中的半數(shù)以上，同時HPV感染可能是宮頸癌年輕化的原因。HPV感染的疾病逐步進展到宮頸上皮內高度病變和癌癥，需要一個漫長的過程8～15年，如果在此期間對其進行干預，可以延緩和阻止病變的進一步發(fā)展1。在桿狀病毒一昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達的HPV16L1病毒樣顆粒同真正的病毒粒子大小相似，并有較好抗原性，故目前LL自身或L1和L2共同裝配成的VLPS是HPV預防性候選疫苗的研究熱點2。隨著研究的進展，針對E區(qū)與L區(qū)的不同特點，又發(fā)展出了不同的疫苗3。3

簡介：復旦大學博士學位論文胃腸道間質瘤臨床病理及分子生物學研究姓名侯英勇申請學位級別博士專業(yè)腫瘤學指導教師朱雄增200241摘籃儀2例何突變74％，2／27，差異有顯著性X。1439，P一5CM、核分裂像5～10個／50HPF、有CKIT基因突變者對提示交界性或惡性有一定的幫助。與GIST預后可能相關的因素包括年齡、性別及腫瘤發(fā)生部位，術時粘連、轉移、腫瘤性壞死、核分裂像≥10個／50HPF、細胞密集明顯異型提示預后差，后三項可能為獨立的預后指標。，7一T≯關鍵詞胃腸道間葉源性腫瘤；胃腸道間質瘤臨床病理學；免疫組織化學；抗原，CDLL7，CD34；超微結構；卡哈爾細胞；起源或分化原癌鏨因CKIT；基因突變良惡性預后本項目得到上海市科委基會R軟組織和骨腫瘤的細胞及分子遺1々，、產(chǎn)俐F_宄J堰盒編號974119025以及復旦大學三年行動計劃985二程壩I|2II|JLJEXFL59301坫倉資助。

簡介：山東大學博士學位論文多發(fā)性腦膜瘤的分子生物學及臨床特性研究姓名宮杰申請學位級別博士專業(yè)神經(jīng)外科指導教師吳承遠朱樹干20060518山東大學博I二學位論文引言腦膜瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見腫瘤，由腫瘤性腦膜上皮細胞組成，來源于蛛網(wǎng)膜帽狀細胞。腦膜瘤的發(fā)生和L發(fā)展是一個多步驟、多基因、多因素參與、多階段的復雜過程，涉及到癌基因活化和抑癌基因失活，最后導致基因表達異常。腦膜瘤可分為單發(fā)性腦膜瘤和多發(fā)性腦膜瘤。多發(fā)性腦膜瘤在臨床上少見，其發(fā)生的部位、腫瘤大小各異，在顱內影響部位不同，臨床癥狀和體征也各異。對于多發(fā)性腦膜瘤，目前研究尚不充分，現(xiàn)有的關于多發(fā)性腦膜瘤的文獻報道，大多為個例報告或小宗的病例回顧，但生物學特性方面的研究仍然很少，對其確切的發(fā)生機制也未完全了解，而且有關多發(fā)性腦膜瘤和單發(fā)性腦膜瘤之間的詳細對比也少見報道。近年來對NF2基因的突變研究較多，但是對于發(fā)生在其它惡性腫瘤中的TIMP一3矛F(xiàn)ITIIBSL等腫瘤相關基因在脯I膜瘤發(fā)生中的研究卻很少，尚無文獻報道這三種基因在多發(fā)性腦膜瘤發(fā)病機制中的作用。本研究分為如下三部分第一部分為腦膜瘤中NF2、TIMP一3、THBSI基因CPG島甲基化及其診斷價值研究，主要目的是應用甲基化特異的PCRMETHYLATIONSPECIFICPCR，MSP方法建立腦膜瘤的甲基化譜，從基因的DNA水平對腦膜瘤進行研究。通過檢測NF2、TIMP一3和TIIBSL基因啟動子區(qū)異常甲基化情況，以揭示基因甲基化在腦膜瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，探討基因甲鏨化在腦膜瘤的早期診斷、治療和預后評估中的價值。第二部分為MMP一9、PR、KI一67和SURVIVIN在多發(fā)性腦膜瘤中的表達及其意義的研究，主要目的是應用免疫組織化學技術，從基因的蛋白水平對腦膜瘤進行研究。通過對比檢測單發(fā)性和多發(fā)性腦膜瘤組織中MMP一9、PR、KI一67和SURVIVIN的表達情況，研究多發(fā)性腦膜瘤的生物學特性。第三部分為多發(fā)性腦膜瘤的臨床特性研究，本課題將十幾年來收集保存下來的多發(fā)性腦膜瘤患者的臨床病例對照同期的單發(fā)性腦膜瘤進行匯總分析，主要目的是系統(tǒng)的研究多發(fā)性腦膜瘤的臨床特性，以更好地指導臨床診斷和治療。