簡(jiǎn)介：鼠抗人CD28分子功能性單克隆抗體的研制及其生物學(xué)的特性的鑒定中文摘要鼠抗人CD28分子功能性單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的研究中文摘要機(jī)體免疫應(yīng)答過程的復(fù)雜性和嚴(yán)格的調(diào)控性，是由多種免疫細(xì)胞和免疫分子共同參與而完成的。而免疫應(yīng)答的核心是T淋巴細(xì)胞的活化。研究表明，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化、增殖及分化為效應(yīng)細(xì)胞需要雙信號(hào)刺激第一信號(hào)來自抗原由TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)并由粘附分子增強(qiáng)第二信號(hào)即協(xié)同刺激信號(hào)由APCS表面的協(xié)同刺激分子和T細(xì)胞的相應(yīng)受體相互作用后產(chǎn)生。協(xié)同刺激分子主要分為免疫球蛋白超家族、TNFTNFR超家族及細(xì)胞因子超家族三種。B7CD28屬于免疫球蛋白超家族，其提供的第二信號(hào)，是迄今為止公認(rèn)的最基本的協(xié)同刺激信號(hào)。B7家族分子屬于免疫球蛋白超家族，其成員主要有B71CD80B72CD86B7HLPDLIB7DCPDL2B7H2GL50和B7H3等，主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞APC表面。但近年來的研究證實(shí)，部分B7家族分子還表達(dá)于關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)腔T細(xì)胞、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血T細(xì)胞、DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)一段時(shí)間后的丁細(xì)胞表面。CD28分子為MR44KD的同源二聚體組成的I型跨膜糖蛋白。1980年首先由HANSEN等用單克隆抗體發(fā)現(xiàn)，隨后將人的CD28分子基因克隆并表達(dá)，主要表達(dá)于95的CD4’丁細(xì)胞和50的CD8T細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、成熟胸腺細(xì)胞和部分NK細(xì)胞等。與其天然配體CD80CD86分子結(jié)合形成的協(xié)同刺激信號(hào)，在免疫應(yīng)答的早期發(fā)揮重要作用。其在降低T細(xì)胞活化閡值、調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和THLTH2分化、誘導(dǎo)抗凋亡基因BCLXL表達(dá)、增加細(xì)胞因子工L2的分泌、促進(jìn)免疫突觸形成及阻止T細(xì)胞失能等方面均具有重要作用。對(duì)該信號(hào)進(jìn)行選擇性調(diào)控，可促使機(jī)體對(duì)腫瘤的排斥和腫瘤細(xì)胞的殺傷，有助于自身免疫性疾病或超敏反應(yīng)及異體器官移植排斥的防治。另外，可溶性CD28分子在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮何種作用，在腫瘤、免疫缺陷病、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中又鼠抗人CD28分子功能性單克隆抗體的研制及其生物學(xué)的特性的鑒定中文摘要余3株能部分阻斷對(duì)照單抗與U266的結(jié)合，提示該3株單抗與陽性對(duì)照單抗識(shí)別不同或不完全相同的抗原位點(diǎn)。將生長(zhǎng)良好、高表達(dá)CD28分子的人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266和XG1、新鮮分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMCT惡性淋巴瘤細(xì)胞株JURKAT和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞CD28T分別與抗體反應(yīng)，通過間接免疫熒光法和流式細(xì)胞儀FCM分析，結(jié)果顯示，5株單抗均能良好地識(shí)別表達(dá)在不同細(xì)胞上的CD28分子。14單抗對(duì)PBTC的激發(fā)效應(yīng)及活化T細(xì)胞的表型分析采用CD28單抗聯(lián)合激發(fā)型CD3單抗激發(fā)PBTC通過FICOLL密度梯度法和磁珠陰性選擇去除CD19CD56陽性細(xì)胞即B細(xì)胞和NK細(xì)胞后獲得。鼠抗人CD3單抗05U9ML包被96孔板，LOOP1孔，吸去包被液，PBS洗滌2遍。用含15?S的RPMI1640培養(yǎng)基將PBTC調(diào)整細(xì)胞濃度為6X105ML，接種于96孔板。3HTDR摻入法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，8G8聯(lián)合激發(fā)型CD3單抗能明顯促進(jìn)PBTC的增殖，刺激指數(shù)為740直接免疫熒光法和流式細(xì)胞儀分析，CD4CD25ICOS和41BB的表達(dá)在培養(yǎng)至24H時(shí)即明顯上調(diào)，72H的陽性表達(dá)率可達(dá)90左右，表明上述分子均為誘導(dǎo)性表達(dá)分子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示，直至培養(yǎng)96H時(shí)，活化T細(xì)胞CD8陽性細(xì)胞的百分率未見明顯改變，提示該株單抗〔8G8促進(jìn)T細(xì)胞向CD4陽性T細(xì)胞極化。激發(fā)的T細(xì)胞中，CD4CD25T細(xì)胞陽性百分率可達(dá)60左右，而該亞群T細(xì)胞在正常人群體內(nèi)，僅占外周血CD4T細(xì)胞510，且能夠抑制CD8T細(xì)胞的活化與增殖。但活化誘導(dǎo)的CD4CD25T細(xì)胞與天然CD4CD25T細(xì)胞其它表型及在免疫應(yīng)答中的功能有何不同，尚需進(jìn)一步探討。2可溶性CD28分子檢測(cè)試劑方法的初步建立215株單抗的BIOTIN標(biāo)記按照上述方法進(jìn)行單抗的制備和純化，用碳酸鹽緩沖液分別將2D52F53B63F8和8G8濃度調(diào)整為200AGML，透析過夜后，加入BNHSDMSO40P1LMGML震蕩4小時(shí)后對(duì)PBS透析72H，分裝后一20℃保存?zhèn)溆谩?25株單抗識(shí)別抗原位點(diǎn)的鑒定分別將5株單抗TUG加1，100111孔包被酶聯(lián)檢測(cè)板，4℃過夜后，4BSA封閉，PBS洗滌后，加入RHCD28FC標(biāo)準(zhǔn)品500NGML100U1孔，37C孵育1H

簡(jiǎn)介：第一部分重慶地區(qū)家雞和家鴨博爾納病病毒自然感染狀況研究目的為了探討重慶地區(qū)家雞和家鴨博爾納病病毒BDV的自然感染狀況，分析重慶地區(qū)家雞和家鴨自然感染的BDVP24核苷酸序列與國(guó)外人和動(dòng)物來源BDV分離株及其標(biāo)準(zhǔn)株STRAINV和HE／80的同源性。方法本研究采用熒光定量巢式逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)FQNRTPCR檢測(cè)重慶地區(qū)120例家雞和120例家鴨外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMCS中BDVP24基因片段，并對(duì)陽性樣本的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)FQPCR產(chǎn)物進(jìn)行基因序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與國(guó)外人與動(dòng)物來源的BDV分離株及其標(biāo)準(zhǔn)株STRAINV和HE／80進(jìn)行序列比較。結(jié)果家雞PBMCS中BDVP24基因片段陽性率為167％2／120，家鴨PBMCS中BDVP24基因片段陽性率為0％O／120。重慶地區(qū)家雞感染的BDV的P24核苷酸序列與國(guó)外患病馬源BDV分離株H1766同源性最高，為9651％，與標(biāo)準(zhǔn)株STRAINV和HE／80同源性均為9535％。結(jié)論重慶地區(qū)家雞中存在動(dòng)物源性BDV自然感染，其感染的BDVP24核苷酸序列與動(dòng)物來源的BDVH1766株及其標(biāo)準(zhǔn)株STRAINV和HE／80存在高度的同源性。本研究不支持重慶地區(qū)家鴨中存在BDV自然感染。第二部分重慶地區(qū)山羊博爾納病病毒自然感染狀況研究目的探討中國(guó)重慶地區(qū)山羊BDV的自然感染狀況，比較分析中國(guó)重慶地區(qū)山羊自然感染BDVP24基因序列與國(guó)外人和動(dòng)物來源BDV分離株及其標(biāo)準(zhǔn)株STRAINV和HE／80的同源性。方法采用FQNRTPCR檢測(cè)了中國(guó)重慶地區(qū)60例山羊PBMCS中和大腦組織左側(cè)海馬BDVP24基因片段，對(duì)陽性標(biāo)本FQPCR產(chǎn)物進(jìn)行基因序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與國(guó)外人與動(dòng)物來源的BDV分離株以及標(biāo)準(zhǔn)株STRAINV和HE／80進(jìn)行序列比較。結(jié)果山羊外周血組BDVP24基因片段陽性率為83％5／60，腦組織組BDVP24基因片段陽性率為L(zhǎng)O％6／60。山羊外周血組陽性率高于腦組織組，但兩組之間差異無顯著性意義PO05。測(cè)序分析結(jié)果表明，重慶地區(qū)山羊感染的BDVP24的核苷酸序列與國(guó)外患病馬源BDV分離株H1766同源性最高，為9651％，與標(biāo)準(zhǔn)株STRAINV和HE／80同源性為9535％。結(jié)論重慶地區(qū)山羊中存在動(dòng)物源性BDV自然感染，該地區(qū)感染的BDVP24核苷酸序列與標(biāo)準(zhǔn)株STRAINV和HE／80存在高度的同源性。外周血組和腦組織組的檢出結(jié)果高度吻合，在運(yùn)用FQNRTPCR檢測(cè)山羊的BDV感染時(shí)可以用外周血標(biāo)本代替腦組織標(biāo)本。第三部分博爾納病病毒感染與精神病發(fā)病的關(guān)系研究目的探討重慶地區(qū)精神分裂癥SCHIZOPHRENIA，SCH患者和抑郁癥DEPRESSIVEDISDER，DD患者BDV自然感染狀況及BDV感染與SCH發(fā)病和DD發(fā)病之間的關(guān)系。方法采用FQNRTPCR檢測(cè)了60例SCH患者、60例DD患者和120例健康人PBMCS中BDVP24基因片段，對(duì)陽性標(biāo)本的FQPCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和基因序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果同國(guó)外人和動(dòng)物來源的BDV分離株以及其標(biāo)準(zhǔn)株STRAINV和HE／80進(jìn)行序列比較。結(jié)果SCH組BDVP24基因片段陽性率為667％4／60；DD組BDVP24基因片段陽性率為5％3／60；健康組陽性率為O％O／120。SCH組陽性率高于健康組，差異有顯著性意義PO05。DD組陽性率高于健康組，差異有顯著性意義PO05。測(cè)序結(jié)果顯示SCH患者和DD患者的BDVP24核苷酸序列均與馬源的BDV病毒株H1766親緣關(guān)系最近，同源性均為9768％。與國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)病毒株STRAINV和HE／80比較，同源性均分別為965L％和9535％。結(jié)論重慶地區(qū)SCH患者和DD患者中存在BDV自然感染，其來源可能為動(dòng)物源性，BDV感染與SCH和DD的發(fā)病均可能相關(guān)。

簡(jiǎn)介：通過檢測(cè)COX2及相關(guān)指標(biāo)在人類肺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)參數(shù)間的關(guān)系COX2在影響肺癌組織細(xì)胞凋亡、腫瘤血管形成、侵襲及轉(zhuǎn)移性等方面的作用及其分子機(jī)制擬為臨床病理診斷和針對(duì)肺癌的新藥開發(fā)與治療提供一定的理論依據(jù)1肺癌中COX2蛋白表達(dá)升高且在各組織學(xué)類型肺癌中的表達(dá)不同腺癌鱗癌大細(xì)胞癌小細(xì)胞癌未見表達(dá)提示COX2參與了人類肺癌的形成并在不同組織學(xué)類型肺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮不同作用不同組織學(xué)類型的肺癌的形成機(jī)制有所區(qū)別因此它們會(huì)具有不同的生物學(xué)行為需要制定有針對(duì)性的治療方案2肺癌中COX2蛋白在不同肉眼類型組的表達(dá)有差異周圍型肺癌中COX2的表達(dá)水平高于中央型肺癌組由于中央型肺癌多為鱗癌周圍型肺癌多為腺癌而我們的結(jié)果也證實(shí)肺腺癌中COX2的表達(dá)高于鱗癌兩結(jié)果彼此相符因此從肉眼類型角度也反映了不同類型肺癌中COX2的作用不同為不同類型肺癌的臨床診斷和將COX2選擇性抑制劑應(yīng)用于臨床治療提供理論依據(jù)3將Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ、Ⅳ分別合并為新的兩組它們之間COX2的表達(dá)有顯著性差異晚期肺癌中COX2的表達(dá)升高更明顯說明它在肺癌進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用4KRAS在肺癌中的表達(dá)活性明顯升高與COX2的表達(dá)具有顯著正相關(guān)關(guān)系且在不同組織學(xué)類型肺癌中表達(dá)水平不同5肺癌中COX2與凋亡抑制因子MCL1的表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系7CD44陽性組中MVD值高于CD44陰性組KRAS陽性組中MVD值高于KRAS陰性組統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性且MVD值與KRAS蛋白的表達(dá)水平具有正相關(guān)關(guān)系8腫瘤MVD是一種與分期、分級(jí)以及病人預(yù)后相關(guān)的指標(biāo)肺癌中COX2陽性組中MVD值高于COX2陰性組且MVD值與COX2的表達(dá)水平具有正相關(guān)關(guān)系9肺癌中COX2與KRAS的表達(dá)呈明顯正相關(guān)關(guān)系10采用北京航空航天大學(xué)CMIAS2000型多功能真彩病理圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行體視學(xué)分析和MVD檢測(cè)獲取定量資料用于分析所得的結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道基本一致是病理學(xué)定量研究中的一種可行、可信的方法

簡(jiǎn)介：在本系列研究的第一部分，首先分析內(nèi)分泌疾病致低血鉀、血鉀濃度與臨床表現(xiàn)、心電圖變化的相關(guān)性，并觀察補(bǔ)鉀治療后血鉀和心電圖恢復(fù)情況。本研究入選42例各種內(nèi)分泌疾患所致低血鉀的患者，觀察臨床表現(xiàn)、血鉀濃度與心電圖變化的關(guān)系，其中24例全程跟蹤補(bǔ)鉀治療中及治療后的臨床表現(xiàn)、血清鉀濃度和心電圖變化。42例低血鉀患者臨床表現(xiàn)為乏力以雙下肢為重、心悸、胸悶，嚴(yán)重低血鉀者表現(xiàn)為四肢軟癱以及肌肉酸痛。血鉀濃度為260±055MMOL1，心電圖低血鉀改變與血清鉀生化測(cè)定符合率為882％。血清鉀25MMOL1時(shí)，兩者符合率為100％。1L例原發(fā)性醛固酮增多癥患者入院時(shí)血鉀為254±060MMOL1；補(bǔ)鉀治療40小時(shí)后血鉀335±044MMOL1，血鉀濃度、臨床表現(xiàn)及心電圖恢復(fù)正常時(shí)間較長(zhǎng)。8例糖尿病酮癥酸中毒或糖尿病合并高血壓患者入院時(shí)血鉀258±042MMOL1；補(bǔ)鉀治療40小時(shí)后血鉀372±017MMOL1；血清鉀濃度、臨床表現(xiàn)及心電圖恢復(fù)正常所需時(shí)間也較長(zhǎng)。5例甲亢周期性麻痹患者入院時(shí)血鉀最低為175±060MMOL1，補(bǔ)鉀治療15小時(shí)后血鉀355±053MMOL1；血清鉀濃度臨床表現(xiàn)及心電圖恢復(fù)正常需要的時(shí)間較原發(fā)性醛固酮增多癥組或糖尿病酮癥酸中毒組短。結(jié)論低血鉀的臨床表現(xiàn)除與低鉀血癥的嚴(yán)重程度有關(guān)外，還與低鉀血癥發(fā)生的急緩有關(guān)。心電圖能較好地反映低血鉀的嚴(yán)重程度。內(nèi)分泌疾病所致低血鉀由于病因不同而出現(xiàn)不同程度的臨床表現(xiàn)及心電圖變化，且經(jīng)補(bǔ)鉀治療后恢復(fù)正常所需時(shí)間也不同。補(bǔ)鉀需補(bǔ)至血清鉀濃度和心電圖恢復(fù)正常為止。在本系列研究的第二部分，我們對(duì)低血鉀周期性麻痹的分子機(jī)制進(jìn)行探討。低血鉀周期性麻痹可分為特發(fā)性低鉀周期性麻痹、甲亢伴低鉀麻痹和家族性低鉀周期性麻痹，三類皆有遺傳因素參與，但家族性低血鉀性周期性麻痹HYPOKALEMICPERIODICPARALYSIS，HOKPP，低鉀周麻更加確切，是一種與遺傳有關(guān)的離子通道疾病，為常染色體顯性遺傳。目前已證實(shí)與家族低鉀周麻發(fā)病相關(guān)的突變類型約有十種，涉及三個(gè)基因CACNALS、SCN4A和KCNE3，分別編碼人骨骼肌CA通道、NA通道和K通道。不同突變類型所致低鉀周麻的臨床表現(xiàn)各異，而明確低鉀周麻的原因有利臨床治療。我們運(yùn)用PCR擴(kuò)增及反應(yīng)產(chǎn)物直接測(cè)序的方法，對(duì)一個(gè)中國(guó)人低鉀周麻家系進(jìn)行基因篩查，并運(yùn)用亞克隆方法進(jìn)行證實(shí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在編碼NA通道的基因SCN4A上第2014位核苷酸存在一個(gè)新點(diǎn)突變CGTLTGT，為雜合突變，并引起相應(yīng)編碼氨基酸的改變，由原來的精氨酸ARGINE變?yōu)榘腚装彼酑YSTINE，SCN4AARG672CYS此突變?yōu)镠OKPP一個(gè)新的突變類型，并且經(jīng)亞克隆的方法進(jìn)一步證實(shí)了此雜合突變。這是國(guó)內(nèi)第一次報(bào)道的中國(guó)人低鉀周麻家系，且證實(shí)一新的雜合突變發(fā)生在SCN4A12號(hào)外顯子，此點(diǎn)突變只在HOKPP患者中存在。而且，家系中各攜帶有此突變的患者的表現(xiàn)并不相同，提示了R672C突變型可能具有不完全外顯的特性。在本系列研究的第三部分，我們分析LIDDLE綜合征家系臨床資料及進(jìn)行分子生物學(xué)研究，探討其發(fā)病機(jī)制。詳細(xì)采集先證者及其家庭成員共16人的病史并行各項(xiàng)相關(guān)生化檢查，明確LIDDLE綜合征的診斷。采集外周血抽提DNA，運(yùn)甩PCR直接擴(kuò)增測(cè)序方法，尋找上皮細(xì)胞鈉通道Β及Γ亞單位ΒENAC，ΓENAC的編碼基因SCNNLB、SCNNLG可能存在的遺傳學(xué)改變。先證者為23歲男性，高血壓史一年余，多次低血鉀發(fā)作，血鉀最低達(dá)18MM0110血管腎素活性基礎(chǔ)和激發(fā)值均降低，血醛固酮和尿醛固酮在正常低限。予口服氨苯喋啶每日400RAG，治療一月后血壓下降至13075MMHG，血鉀升至366MMO11。臨床確診為L(zhǎng)IDDLE綜合征。先證者二舅有高血壓低血鉀肌麻痹發(fā)作史，曾測(cè)血鉀為21MMO1L。先證者三姐有低血鉀肌麻痹發(fā)作史2次，血鉀最低達(dá)25MMOL1。編碼ΒENAC基因SCNNLB第13號(hào)外顯子的DNA測(cè)序結(jié)果顯示，先證者Ⅲ8、大姐Ⅲ5、三姐Ⅲ7、母親Ⅱ5和二舅Ⅱ3第616位密碼子存在CCC→CAC錯(cuò)義突變，引起相應(yīng)脯氨酸到組氨酸的改變。對(duì)100例無關(guān)個(gè)體進(jìn)行直接測(cè)序未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)變異，證明此為一新突變類型。其他家系成員均未發(fā)現(xiàn)這一基因突變。YENAC基因測(cè)序未發(fā)現(xiàn)突變。本家系中發(fā)現(xiàn)的SCNNLB基因第616位密碼子CCCCAC錯(cuò)義突變?yōu)長(zhǎng)IDDLE綜合征又一新致病基因類型。對(duì)家系成員進(jìn)行基因檢測(cè)有助于早期篩選突變攜帶者，以便早期干預(yù)治療。在本系列研究的第四部分，我們對(duì)一少見的CUSHING綜合征類型即異位ACTH分泌綜合征的臨床特征進(jìn)行分析，而其較為突出的特征既是6例患者皆有嚴(yán)重低血鉀癥及堿中毒傾向?？偨Y(jié)胸腺類癌一異位ACTH綜合征以低血鉀為首發(fā)臨床癥狀，分析六例病人的臨床表現(xiàn)，尤其是非典型胸腺類癌一異位ACTH綜合征的癥狀和體征、實(shí)驗(yàn)室相關(guān)測(cè)定值、以及影像學(xué)表現(xiàn)。6例患者年齡在2240歲，4男、2女，所有患者均在典型柯興綜合癥表現(xiàn)基礎(chǔ)上，具異位ACTH分泌綜合征特征，皆有面部皮膚色素沉著、低血鉀堿中毒的傾向，平均血鉀為229±002MMOL1、血PH值為744±002；2MG地塞米松和8MG地塞米松抑制試驗(yàn)均不被抑制；4例患者以浮腫、蛋白尿就診。6例皆行垂體MRI，診為垂體微腺瘤者3例占50％，僅2例腎上腺CT掃描示雙側(cè)腎上腺增生，6例皆常規(guī)胸片，3例發(fā)現(xiàn)縱膈增寬，但胸部CT全部顯示“前縱膈占”。6例病人均行胸腺腫瘤切除術(shù)并病理證實(shí)為胸腺類癌一異位ACTH綜合征。本項(xiàng)臨床觀察說明如果有明確CUSHING綜合征臨床表現(xiàn)，而未發(fā)現(xiàn)垂體瘤或。腎上腺腺瘤，或即便有垂體微腺以及腎上腺增生，但伴有低血鉀、浮腫、蛋白尿且出現(xiàn)不能解釋的大劑量地賽米松抑制試驗(yàn)結(jié)果，均應(yīng)考慮異位ACTH分泌綜合征，且最可能的原因是胸腺類癌。

簡(jiǎn)介：分類號(hào)蘭鯊三UDC碩士學(xué)位論文密級(jí)編號(hào)豬星狀病毒分離鑒定和分子流行病學(xué)調(diào)查及生物學(xué)特性研究蘭家暖學(xué)科專業(yè)亟隨獸醫(yī)堂指導(dǎo)教師黃焦堅(jiān)數(shù)援一論文答辯日期2Q生旦曼Q旦學(xué)位授予日期2Q生魚且答辯委員會(huì)主席矍廷苤教攫論文評(píng)閱人隆淫搓嬰究員趙武巫究員豬星狀病毒分離鑒定和分子流行病學(xué)調(diào)查及生物學(xué)特性研究摘要星狀病毒ASTROVIRUS，ASTV屬于人獸共患病病原，與多種動(dòng)物的腹瀉性疾病有關(guān)，目前廣泛分布于世界各地。星狀病毒常同冠狀病毒、輪狀病毒、嵌杯狀病毒及其它腸道病毒混合感染造成急性胃腸炎，尤其對(duì)小孩及幼畜危害最大。本研究對(duì)豬星狀病毒進(jìn)行分離鑒定和分子流行病學(xué)調(diào)查及生物學(xué)特性研究，將為今后預(yù)防豬星狀病毒感染和傳播提供實(shí)驗(yàn)方法和手段。通過對(duì)廣西某豬場(chǎng)經(jīng)RTNPCR檢測(cè)呈豬星狀病毒陽性的糞樣進(jìn)行病毒分離，獲得兩株能在PK15細(xì)胞上增殖，并能使該細(xì)胞變大、胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒，最后細(xì)胞破碎、脫落等細(xì)胞病變的病毒；在電鏡下觀察，該病毒呈典型的星狀結(jié)構(gòu)，直徑約28一35NM；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，攻毒豬出現(xiàn)溫和性腹瀉，體重減輕，腸系膜淋巴結(jié)腫大和腸絨毛變短等臨床癥狀和在絨毛上皮細(xì)胞層及絨毛腔有大量淋巴細(xì)胞及少量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。病毒的成功分離，為豬星狀病毒分子生物學(xué)以及致病機(jī)制的研究提供材料。應(yīng)用RTNPCR方法，對(duì)采自廣西7個(gè)市縣27個(gè)不同規(guī)模化豬場(chǎng)和廣東湛江2個(gè)不同規(guī)?；i場(chǎng)共315份豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示豬場(chǎng)陽性率達(dá)828％24／29；樣品陽性率達(dá)403％127／315；030日齡的小豬感染率最高，達(dá)449％53／118；春季24月感染率最高，為543％38／70。調(diào)查結(jié)果表明，豬群中普遍存在豬星狀病毒感染。另外，L

簡(jiǎn)介：廈門大學(xué)博士學(xué)位論文AXIN復(fù)合體調(diào)控P53活性的分子機(jī)制及其生物學(xué)功能姓名林舒勇申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師林圣彩20090401ABSTRACTABSTRACTCELLSCANUNDERGOCELLCYCLEAFFESTTOREPAIRDAMAGEDDNAORAPOPTOSISTOELIMINATEPERMANENTLYDAMAGEDCELLSTHATCARRYINACCURATEGENETICINFORMATIONFOLLOWINGGENOTOXICSTRESSESTHETWOCELLFATESALEDETERMINEDBYSIGNALINGCASCADESTHATSEEMTOCONVERGEONP53SIGNALINGHOWEVERHOWTHRESHOLDSOFP53ACTIVATIONAREINTRICATELYCONTROLLEDBYORCHESTRATIONOFINCREASINGLYMANYFACTORSREMAINSUNCLEARHEREWESHOWTHATAXIN，ACENTRALREGULATOROFWNTSIGNALING，F(xiàn)ORMSDISTINCTCOMPLEXESWITHPIRH2ANDTIP60ASWELLASHIPK2ANDP53ATTHEIRENDOGENOUSLEVELS，DURINGDIFFERENTCELLULARCOMMITMENTSINCELLSTREATEDWITHSUBLETHALDOSESOFUVORDOXORUBICIN，PIRH2ABROGATESAXININDUCEDP53PHOSPHORYLATIONATSER46CATALYZEDBYHIPK2，THROUGHCOMPETINGAGAINSTHIPK2BINDINGTOAXINHOWEVERINRESPONSETOLETHALTREATMENTS，TIP60INTERACTIONWITHAXINISINCREASEDBYATM／ATRKINASESANDPUSHESOFFPITH2，F(xiàn)ORMINGAXINTIP60一HIPK2P53COMPLEXTHATALLOWSFORMAXIMALP53ACTIVATIONTOTRIGGERAPOPTOSISP53TRANSACTIVATIONISGREATLYCOMPROMISEDUPONLETHALDOXTREATMENTINTHESKINFIBROBLASTSDERIVEDFROMAXINF。HMICECOINCIDINGWITHAX／NMUTATIONPROMOTESCARCINOGENESISINAXI矗U7MICEANDTHEDOMINANTNEGATIVEROLEOFAXIN盹PROTEINONP53ACTIVATIONTHUS，AXINISACRITICALDETERMINANTFORP53DEPENDENTTUMORSUPPRESSION，INWHICHPIRH2ANDTIP60PLAYSWITCHINGROLESTOTRIGGERCELLCYCLEARRESTORAPOPTOSISUPONDIFFERENTSEVERITYOFGENOTOXICSTRESSKEYWORDSAXIN；P53APOPTOSISDNADAMAGE

簡(jiǎn)介：中山大學(xué)碩士學(xué)位論文人免疫缺陷病毒調(diào)升基因AEG1促腫瘤細(xì)胞增殖的生物學(xué)作用與分子機(jī)制研究姓名楊樂申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)微生物學(xué)指導(dǎo)教師黎孟楓20090525中I山大學(xué)碩士論文人免疫缺陷病毒調(diào)升基因AEG1促腫瘤細(xì)胞增羅II的生物學(xué)作用與分子機(jī)制研究腺癌的關(guān)鍵。目前的研究表明乳腺癌的發(fā)生受基因與環(huán)境兩大因素的影響，但對(duì)其發(fā)病的具體的分子機(jī)制卻知之甚少，乳腺癌的預(yù)后的判斷仍然依賴于一些常規(guī)的臨床與影像學(xué)指標(biāo)，例如，腫瘤的大小，病理分級(jí)，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。至今為止，已有許多基因被認(rèn)為足與乳腺癌轉(zhuǎn)移和或預(yù)后有關(guān)的標(biāo)記物，但仍缺乏獨(dú)立、有效的乳腺癌診斷指標(biāo)和與預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記物。因此，闡述乳腺癌發(fā)牛、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找特異性診斷和治療靶標(biāo)是目前乳腺癌基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。本文旨在研究AEGL基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖的影響，并探討其在入乳腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)理。首先，本文做免疫組化檢測(cè)乳腺癌組織中AEG一1與KI67的臨床相關(guān)性。隨后建立了兩株穩(wěn)定外源性高表達(dá)AEGL和兩株下調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性AEG一1表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系，用于檢測(cè)AEG1與乳腺癌細(xì)胞增殖的相關(guān)性。本文的數(shù)據(jù)顯示，上調(diào)AEG1的表達(dá)能夠明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和其非錨定依賴性牛長(zhǎng)的能力，反之下調(diào)內(nèi)源性AEG1的表達(dá)則可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，AEG1可能足促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞異常增生的重要分子。通過對(duì)AEG1促增殖機(jī)制的研究，本文發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞增殖加快與細(xì)胞周期抑制物P27KIPL5陽P21CI01P有關(guān)，進(jìn)而證明了AEG1是通過P13K／AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)FOXOL的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的。本文的發(fā)現(xiàn)首次闡述了AEGL促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，提示AEGL基因在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)腱過程中起重要作用，可能成為有價(jià)值的腫瘤分子治療的潛在靶點(diǎn)。關(guān)鍵詞AEG1乳腺癌增殖

簡(jiǎn)介：天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文組織芯片的研制及應(yīng)用該技術(shù)研究肺癌中EPHB4表達(dá)的生物學(xué)意義和相關(guān)分子機(jī)制姓名朱叢中申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師王新允20040501天津匿辯夾攀壤±磅究壘拳鏈論文鬻一幫靜串寞桷娶第一部分組織芯片的研制摘要目的遂行縫絞芯冀聯(lián)饞胃牙箍援討及鍘幸擎方法酌磷究，為莰遮、糕范、麓裂、經(jīng)濟(jì)她進(jìn)行器項(xiàng)科研工作鞴臨床病瑗診斷褳供一耱新酶技術(shù)方法。方法螯誶蛾塊包挺秘蛾臃癌彝{0翻歪零虢篷緞揀本。籍這些蠟塊均露5P彈切肆常規(guī)HE染色，鏡下確定贖型的腫瘤及正常組織，并在蠟塊上的相應(yīng)部位作好標(biāo)記每個(gè)腫瘤瘸例取4個(gè)點(diǎn)，正常肺則每例取2個(gè)點(diǎn)，按預(yù)先設(shè)計(jì)好的排布順序用我們摸索靜方法餓茂2402012≥纛簿魏綴織芯片螻塊；蔣霓蟮浹饞3墊Ⅸ韜片及隧染色后，轆下觀察結(jié)暴；褥EPHB4多克隧抗體對(duì)綴織芯片藉芯片上籀應(yīng)瘸鍘黥常怒切片進(jìn)行純疫組化染色，對(duì)組織芯片上54例肺癌隨機(jī)取四個(gè)點(diǎn)、三個(gè)點(diǎn)、兩個(gè)點(diǎn)、一個(gè)點(diǎn)，將這幾組結(jié)果與普通免疫縫他的結(jié)果進(jìn)行比較，并討‘籜其褥合棗。結(jié)果1．組織芯片的制作曩我們瓣方法鍘囂融靜芯片翡塊媾袋翅戴均勻，強(qiáng)弱無開裂邋囊。}L耋爨蠡終采燕組踉芯均勻讒布予裁鍍片上，沒有脫冀一，也無嚼顯移位愛翹曲，完全符合浚察的需要。

簡(jiǎn)介：該研究試圖通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)提高或者降低RESISTIN蛋白的表達(dá)觀察此變化是否會(huì)導(dǎo)致參與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)分子表達(dá)的變化并通過分析它們之間的關(guān)系來了解RESISTIN在促進(jìn)胰島素抗性方面可能的分子機(jī)制為2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供資料為此實(shí)驗(yàn)從以下四個(gè)部分進(jìn)行研究第一部分RETN基因全長(zhǎng)CDNA的克隆、表達(dá)及高表達(dá)小鼠RETN基因細(xì)胞系的建立第二部分RETN基因的SIRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和小鼠RETN基因被KNOCKDOWN3T3L1細(xì)胞系的建立第三部分小鼠RETN基因表達(dá)的變化對(duì)3T3L1細(xì)胞葡萄糖攝取及胰島素信號(hào)蛋白表達(dá)的影響第四部分膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體內(nèi)RETN基因的表達(dá)極其對(duì)肌肉組織葡萄糖攝取的影響結(jié)論基于上述的研究結(jié)果我們認(rèn)為1該論文已完成高表達(dá)和低表達(dá)小鼠RETN基因的3T3L1細(xì)胞系的建立該模型的完成為進(jìn)一步研究RESISTIN蛋白引發(fā)胰島素抗性的分子生物學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)2該研究已經(jīng)證明小鼠RESISTIN蛋白有導(dǎo)致3T3L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的作用這種作用的產(chǎn)生與胰島素信號(hào)通路中PI3K和RAS途徑信號(hào)蛋白的表達(dá)的改變相關(guān)3肥胖伴胰島素抵抗小鼠脂肪組織中RETN基因的表達(dá)高于正常小鼠的脂肪組織RESISTIN蛋白的表達(dá)能夠降低小鼠肌肉組織葡萄糖的攝取提示RESISTIN蛋白的表達(dá)在胰島素抗性的形成中發(fā)揮作用

簡(jiǎn)介：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（POSTMENOPAUSALOSTEOPOSIS，PMO）及骨質(zhì)疏松性骨折是中老年婦女常見的代謝性骨病之一，其發(fā)病主要是由于雌激素缺乏導(dǎo)致的骨代謝異常。以往主要采用雌激素替代療法（ESTROGENREPLACEMENTTHERAPY，ERT）來防治PMO但ERT可導(dǎo)致陰道不規(guī)則出血、體重增加、乳房痛、子宮內(nèi)膜增生等副作用，長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)增加患乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的危險(xiǎn)性。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）具有誘導(dǎo)成骨作用在局部應(yīng)用BMP治療骨不連、骨缺損已取得肯定療效，能否將其應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的治療，尚缺乏系統(tǒng)基礎(chǔ)研究。為了解局部應(yīng)用外源性BMP對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的影響及其作用機(jī)制，我們主要進(jìn)行了以下研究工作⑴建立骨質(zhì)疏松山羊模型，于骨質(zhì)疏松山羊橈骨遠(yuǎn)端注射生理鹽水、纖維蛋白膠及纖維蛋白膠復(fù)合BMP。⑵通過應(yīng)用MICROCT檢測(cè)松質(zhì)骨骨密度。通過免疫組化和原位雜交法檢測(cè)去勢(shì)山羊松質(zhì)骨中胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGFI）、骨保護(hù)素（OPG）和腫瘤壞死因子（TNFΑ）的表達(dá)。主要得出的結(jié)果有⑴外源性BMP注射5周后的去勢(shì)山羊，MICROCT檢查橈骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨BMD明顯大于NS組和FS組（P005）。⑵外源性BMP注射5周后，F(xiàn)SBMP組去勢(shì)山羊松質(zhì)骨IGFI表達(dá)陽性灰度值較NS組和FS組明顯降低（P005），表明局部應(yīng)用外源性BMP后，去勢(shì)山羊橈骨遠(yuǎn)端IGFI表達(dá)量明顯增加；另一方面，外源性BMP注射5周后，OPG表達(dá)陽性灰度值較NS組和FS組明顯降低（P005）；FSBMP組去勢(shì)山羊松質(zhì)骨TNFΑ表達(dá)灰度值較NS組和FS組明顯增高（P005），表明骨質(zhì)疏松山羊橈骨遠(yuǎn)端OPG表達(dá)量增加，TNFΑ表達(dá)量明顯減少。結(jié)論⑴局部應(yīng)用外源性BMP，對(duì)維護(hù)低雌激素水平情況下局部骨密度具有顯著效果。⑵外源性BMP通過上調(diào)IGFI和OPG的表達(dá)及下調(diào)TNF－Α的表達(dá)，促進(jìn)骨質(zhì)疏松形成過程中的成骨過程及抑制破骨過程，可能是其防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制之一。

簡(jiǎn)介：第一部分人類腸道病毒分子生物學(xué)分型鑒定方法的建立及應(yīng)用。人類腸道病毒HEV是小核糖核酸病毒科的一個(gè)屬，文獻(xiàn)報(bào)道的HEV已有91個(gè)型，分為脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇A組、B組病毒、?？刹《竞托滦湍c道病毒5個(gè)組。人類腸道病毒感染大多表現(xiàn)為隱性感染或癥狀輕微，但也可以引起無菌性腦膜炎、弛緩性麻痹、急性心肌炎、手足口病等嚴(yán)重疾病。常規(guī)的HEV鑒定多采用病毒分離結(jié)合中和試驗(yàn)等血清學(xué)方法，由于HEV血清型繁多，血清學(xué)分型鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究的目的在于建立人類腸道病毒分子生物學(xué)分型鑒定方法，用于臨床分離腸道病毒的分型鑒定。根據(jù)已知各型別人類腸道病毒基因的核苷酸序列和文獻(xiàn)資料，分別合成1對(duì)HEV種屬特異性引物“EV1EV2”和5對(duì)分型鑒定引物“P1P2”、“P1P3”、“P4P7”、“P5P7”和“P6P7”，提取病毒RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RTPCR擴(kuò)增病毒CDNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和核苷酸序列分析，建立了人類腸道病毒的分子生物學(xué)分型鑒定方法。采用該方法鑒定了18株疑似HEV毒株，并與血清中和試驗(yàn)相互驗(yàn)證。結(jié)果表明，經(jīng)種屬特異性引物鑒定，其中17株為人類腸道病毒；采用型特異性引物進(jìn)行分型鑒定，其中4株為科薩奇病毒A24型，3株為科薩奇病毒B3型；科薩奇病毒B2、A9、A15型、?？刹《?、6、7、9、11、14、33型和鼻病毒9型各1株，微量中和試驗(yàn)結(jié)果與分子生物學(xué)方法分型結(jié)果完全符合。本實(shí)驗(yàn)組合運(yùn)用了上述6對(duì)HEV鑒定和分型引物，對(duì)全部引物的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行了統(tǒng)一，可以顯著節(jié)約病原學(xué)檢出時(shí)間，同時(shí)可以確定流行株可能發(fā)生的基因變異情況，與傳統(tǒng)的病毒分離和血清學(xué)鑒定分型方法相比具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可以直接鑒定并分型診斷人類腸道病毒感染，適用于人類腸道病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病學(xué)研究。第二部分乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重的病毒性疾病，雖然近年來抗HBV治療有了很大進(jìn)展，但由于治療性藥物難以徹底清除乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUSHBV，而且具有停藥易復(fù)發(fā)，易引起病毒變異等缺點(diǎn)，所以打破慢性乙肝患者對(duì)HBV的免疫耐受，提高特異性免疫功能目前被認(rèn)為是有望徹底治愈HBV慢性感染的根本措施。本實(shí)驗(yàn)以HBVHBC作為免疫呈現(xiàn)載體，選取畢赤巴斯德酵母PICHIAPASTIS外源基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)乙型肝炎病毒不同免疫表位嵌合抗原，以期用于治療慢性乙肝患者，增強(qiáng)乙肝病毒各抗原表位的免疫原性和抗原性，打破耐受、重建免疫應(yīng)答，激發(fā)慢性乙肝患者體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體和以細(xì)胞毒性T細(xì)胞CYTOTOXICTLYMPHOCYTECTL應(yīng)答為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，以達(dá)到清除肝細(xì)胞內(nèi)病毒的目的。本實(shí)驗(yàn)選取ADR亞型乙肝病毒DNA作為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增獲得編碼HBV核心抗原HBVCEANTIGENHBC178AA、HBC79149AA、PRES1抗原1050AA、PRES2抗原110154AA及S抗原101157AA的五個(gè)基因片段。通過將HBC178AA和HBC79149AA兩個(gè)基因片段酶切連接并插入質(zhì)粒PPIC35K構(gòu)建了以HBC為呈現(xiàn)載體的酵母表達(dá)質(zhì)粒PPIC35KHBC。將擴(kuò)增獲得的PRES1、PRES2和S三個(gè)基因片段插入質(zhì)粒PGEMTHBC2獲得融合基因片段S1C、S2C和SC，之后將融合基因片段插入質(zhì)粒PPIC35K，構(gòu)建了酵母表達(dá)質(zhì)粒PPIC35KHBCS1、PPIC35KHBCS2和PPIC35KHBCS。將表達(dá)質(zhì)粒PPIC35KHBCA、PPIC35KHBCS1和PPIC35KHBCS2以SALI核酸內(nèi)切酶線形化，電穿孔轉(zhuǎn)化GS115酵母細(xì)胞，利用無氨基酸的酵母含氮堿基作為唯一氮源篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子。通過G418加壓篩選，獲取了可以高效表達(dá)融合蛋白的多拷貝整合菌株。對(duì)篩選出的多拷貝整合菌株進(jìn)行甲醇利用表型鑒定，全部菌株均為甲醇利用正常型MUT。對(duì)所選菌株提取酵母基因組DNA，以PCR方法鑒定轉(zhuǎn)化子，確定全部菌株均整合了酵母表達(dá)質(zhì)粒。本研究構(gòu)建了PPIC35KHBCA、PPIC35KHBCS1和PPIC35KHBCS2三個(gè)酵母表達(dá)質(zhì)粒，并將其以高拷貝整合于PICHIAPASTIS酵母表達(dá)系統(tǒng)，為下一步的誘導(dǎo)表達(dá)及融合蛋白的免疫原性研究奠定了基礎(chǔ)。

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簡(jiǎn)介：分類號(hào)密級(jí)國(guó)際十進(jìn)分類號(hào)（UDC）第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)位論文外源性脆性三聯(lián)組氨酸蛋白FHIT對(duì)結(jié)腸癌和肝癌細(xì)胞增殖和凋亡生物學(xué)功能的影響及分子機(jī)制研究（題名和副題名）余桂戎（作者姓名）指導(dǎo)教師姓名楊安鋼教授指導(dǎo)教師單位第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)名稱生物化學(xué)與分子生物學(xué)論文提交日期201004答辯日期201005論文起止時(shí)間2007年9月至2010年5月學(xué)位授予單位第四軍醫(yī)大學(xué)外源性脆性三聯(lián)組氨酸蛋白外源性脆性三聯(lián)組氨酸蛋白FHIT對(duì)結(jié)腸癌和肝癌細(xì)胞增殖和凋亡生物學(xué)功能的影響及分子機(jī)制研究對(duì)結(jié)腸癌和肝癌細(xì)胞增殖和凋亡生物學(xué)功能的影響及分子機(jī)制研究研究生余桂戎生余桂戎學(xué)科專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)科專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)所在單位第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)所在單位第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室教研室導(dǎo)師楊安鋼師楊安鋼教授教授輔導(dǎo)教師張輔導(dǎo)教師張瑞講師講師基金資助項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30873006，30901771）；關(guān)鍵詞FHIT；重組腺病毒；TAT轉(zhuǎn)位肽；融合蛋白；結(jié)腸癌；肝癌；蛋白純化中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)2010年05月

簡(jiǎn)介：近幾年來，主要組織相容性復(fù)合體I類相關(guān)鏈AMAJHISTOCOMPATIBILITYCOMPLEXCLASSIRELATEDCHAINA，MICA抗體與實(shí)體器官移植特別是腎移植的排斥反應(yīng)和移植腎長(zhǎng)期存活率之間的關(guān)系成了移植免疫學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。在等待腎移植的患者體內(nèi)檢測(cè)到了預(yù)存的MICA抗體，說明在移植前患者就接觸到了MICA抗原而產(chǎn)生了特異性的抗體；移植后MICA抗體與免疫排斥反應(yīng)和慢性移植腎失功之間均存在著密切的關(guān)系。由于MICA蛋白可以表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，但不表達(dá)在T淋巴細(xì)胞，因而MICA分子可能直接引起移植腎血管的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致移植腎功能損害。有學(xué)者研究了MICA抗原對(duì)淋巴細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，發(fā)現(xiàn)MICA抗原對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞有促進(jìn)其增殖的作用。最近對(duì)心臟移植的研究中發(fā)現(xiàn)，血清中的可溶性MICASMICA分子可以減輕移植物的免疫損傷，對(duì)移植物起到保護(hù)作用。MICA分子和NKG2D是互為配受體的關(guān)系，且NKG2D是NK細(xì)胞表面的一種激活性受體。但是MICA抗原對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響，SMICA在腎移植中的是否有保護(hù)作用，以及NK細(xì)胞能否被激活而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，均未見報(bào)道。因此，本課題將分三個(gè)部分進(jìn)行研究1應(yīng)用MICA重組蛋白對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行刺激，觀察它對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性及其分泌功能的影響2外源性抗原對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MICA基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以及對(duì)細(xì)胞上清中SMICA的水平的影響；3表達(dá)MICA分子的內(nèi)皮細(xì)胞與NK細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察NK細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷作用，并探討其可能的作用機(jī)制。第一部分MICA抗原對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的影響目的觀察主要組織相容性復(fù)合體I類相關(guān)鏈AMICA抗原對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法將外源性重組MICA蛋白分A55NGML，A1010NGML，A2525NGML三個(gè)劑量加入培養(yǎng)基中作為實(shí)驗(yàn)組，A0組加入等體積的磷酸鹽緩沖液PBS作為對(duì)照組，對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC予以培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞周期和凋亡情況，采用噻唑藍(lán)MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，并測(cè)定各組細(xì)胞上清液中前列環(huán)素代謝產(chǎn)物6酮前列腺素F1Α6KETOPGFLΑ、內(nèi)皮素ET1、組織型纖溶酶原激活物TPA及其抑制物PAI的水平。結(jié)果各實(shí)驗(yàn)組A5，A10，A25內(nèi)皮細(xì)胞A570值均高于對(duì)照組A0。以A5組增殖最為明顯，A10組比A5組稍下降，兩組之間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005），但明顯高于A25組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005）。各實(shí)驗(yàn)組A5，A10，A25TPA、PAI分別為1612，1542，1578NGML2216，2485，2524NGML而對(duì)照組（A0分別為2335NGML、1378NGML。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005）。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞無明顯凋亡，細(xì)胞周期也無明顯改變。結(jié)論MICA抗原對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)周期無明顯影響，也不引起其凋亡，但能刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，以小劑量誘導(dǎo)增殖明顯，并呈持續(xù)緩慢增殖。同時(shí)能夠引起內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，凝血功能增強(qiáng)，而纖溶功能下降，有助于血栓形成。第二部分外源性抗原對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MICA基因表達(dá)的影響目的探討外源性抗原對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MICA基因表達(dá)的影響。方法將MICA重組蛋白分A55NGML，A1010NGML，A2525NGML和熱休克蛋白HSP70分B55NGML，B1010NGML，B2S25NGML各三個(gè)劑量的實(shí)驗(yàn)組，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC予以誘導(dǎo)培養(yǎng)，對(duì)照組A0、B0組分別加等量的磷酸鹽緩沖液PBS。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞MICAMRNA表達(dá)、WESTERNBLOT法檢測(cè)MICA蛋白和流式細(xì)胞儀檢測(cè)MICA蛋白在細(xì)胞膜表面的表達(dá)，用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中可溶性MICASMICA的水平。結(jié)果用三個(gè)劑量MICA重組蛋白誘導(dǎo)48H后，各實(shí)驗(yàn)組A5，A10，A25內(nèi)皮細(xì)胞MICAMRNA和MICA蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組比較均有顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。MICA膜蛋白表達(dá)以A10組326％最高，并與A5組282％、A25組234％之間有顯著性差異P005）。而HSP蛋白組內(nèi)皮細(xì)胞MICA基因的表達(dá)和SMICA水平無明顯改變。結(jié)論外源性MICA抗原能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自身MICAMRNA、總蛋白和膜蛋白表達(dá)上調(diào)，尤其是細(xì)胞膜蛋白增加明顯，但SMICA水平顯著下降，而HSP蛋白組無顯著變化。第三部分MICA分子介導(dǎo)NK細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷作用目的觀察MICA分子在NK細(xì)胞殺傷內(nèi)皮細(xì)胞過程中的作用，探討其可能的機(jī)制。方法使用免疫磁珠方法及CD56陽性分選試劑盒分選NK細(xì)胞，并將NK細(xì)胞與表達(dá)MICA膜蛋白的活化內(nèi)皮細(xì)胞，共同培養(yǎng)10H。NK細(xì)胞與A0組HUVEC（同第二部分）共培養(yǎng)為A組，與A10組為B組。用熒光素進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察死亡和存活細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算NK細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞殺傷效率，用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清中的干擾素ΓIFNΓ）和穿孔素水平。結(jié)果免疫磁珠法可以分選NK細(xì)胞，純度為885％。NK細(xì)胞對(duì)B組內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷效率為355％，明顯高于A組L26％；B組IFNΓ和穿孔素水平顯著高于A組，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P結(jié)論經(jīng)過外源性MICA重組蛋白刺激的內(nèi)皮細(xì)胞表面MICA分子表達(dá)增高，能夠提高NK細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷效率；IFNΓ和穿孔素可能是發(fā)揮細(xì)胞毒作用的活性物質(zhì)。

簡(jiǎn)介：孢子絲菌病是流行于熱帶及亞熱帶地區(qū)由申克孢子絲菌引起的皮膚、皮下組織及其附近淋巴系統(tǒng)的亞急性和慢性感染可累及臟器具有一定致殘、致死率。根據(jù)美國(guó)傳染病協(xié)會(huì)2007版申克孢子絲菌病臨床治療指南推薦伊曲康唑?yàn)榉窍到y(tǒng)性孢子絲菌病的首選單獨(dú)治療藥物。我們?cè)谂R床上發(fā)現(xiàn)3例對(duì)伊曲康唑治療不敏感的皮膚型孢子絲菌病患者從中首次分離出4株申克孢子絲菌臨床耐藥株但申克孢子絲菌的耐藥研究還是空白。本研究通過對(duì)這4株耐藥株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、雙相型轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、掃描電鏡、ITS序列、體外單藥藥敏和聯(lián)合藥敏試驗(yàn)研究同時(shí)采用RAPD技術(shù)進(jìn)行臨床耐藥株和敏感株的基因型差異分析探討申克孢子絲菌耐藥株和敏感株在表型、基因型和藥物敏感性等方面的差異；同時(shí)獲取了其編碼細(xì)胞色素P450羊毛固醇14Α脫甲基酶的耐唑類抗真菌藥物相關(guān)基因的表達(dá)序列片段為分子耐藥機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。目的1明確耐伊曲康唑申克孢子絲菌臨床株的形態(tài)學(xué)表型、基因型和體外藥敏的特性2探討申克孢子絲菌臨床耐藥株和敏感株的基因型差異獲取其耐唑類抗真菌藥物相關(guān)基因的表達(dá)序列片段為分子耐藥機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。方法1通過真菌鏡檢、培養(yǎng)、小培養(yǎng)、雙相轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和掃描電鏡技術(shù)對(duì)所分離臨床耐藥株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；2采用真菌通用引物ITS4、ITS5進(jìn)行PCR擴(kuò)增申克孢子絲菌臨床耐藥株的RDNAITS區(qū)序列產(chǎn)物經(jīng)純化、測(cè)序后進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定；3應(yīng)用M38A方案和改良M27A2藥敏試驗(yàn)方案對(duì)申克孢子絲菌臨床耐藥株進(jìn)行菌絲相和酵母相的體外藥敏試驗(yàn)?；罨攴謩e制備菌絲相和酵母相菌懸液菌絲相濃度調(diào)整至5104CFUML2倍終濃度酵母相調(diào)整至25103CFUML2倍終濃度；采用微量液基稀釋法加樣制板后菌絲相置26℃酵母相置35℃孵育第5D觀察結(jié)果。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為各藥的MIC終點(diǎn)為100％生長(zhǎng)抑制聯(lián)合用藥效果評(píng)價(jià)采用分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)評(píng)價(jià)；4采用OPBG14和OPBG19兩條引物進(jìn)行RAPDPCR擴(kuò)增4株臨床耐藥株及46株臨床非耐藥株及1株標(biāo)準(zhǔn)株。對(duì)擴(kuò)增的RAPD帶型進(jìn)行分析采用BIONUMERICSV461軟件統(tǒng)計(jì)出各菌株的歐式遺傳距離并按照WARDSALGITHMWITHJACCADSCOEFFICIENT法進(jìn)行聚類分析繪出親緣關(guān)系樹狀圖。5提取申克孢子絲菌總RNA逆轉(zhuǎn)錄后采用針對(duì)耐唑類抗真菌藥物相關(guān)基因編碼細(xì)胞色素P450羊毛固醇14Α脫甲基酶基因片段的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果14株耐伊曲康唑申克孢子絲菌臨床株經(jīng)真菌培養(yǎng)、小培養(yǎng)、雙相轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和掃描電鏡技術(shù)鑒定符合申克孢子絲菌的真菌學(xué)特征；2臨床耐藥株均能擴(kuò)增出400～600BP左右的RDNAITS區(qū)域片段所有片段的測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)與申克孢子絲菌的模式菌株具有99％～100％同源性；3臨床耐藥株在酵母相的伊曲康唑單藥藥敏結(jié)果顯示較高的MIC值均達(dá)到2ΜGML。臨床耐藥株與敏感株兩組在酵母相的伊曲康唑單藥藥敏MIC值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P002而菌絲相則無差異P0119005；兩組的特比萘芬單藥藥敏結(jié)果無論酵母相和菌絲相均無差異；4聯(lián)合藥敏MIC值均明顯低于單藥藥敏MIC值。兩藥聯(lián)合藥敏結(jié)果顯示在菌絲相耐藥株和非耐藥株均無相關(guān)作用在酵母相中有2株菌的FICI結(jié)果顯示聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用其余則表現(xiàn)為無相關(guān)作用和拮抗作用。其中臨床耐藥株SUMS0382在酵母相的伊曲康唑和特比萘芬聯(lián)合藥敏FICI為0375顯示了兩種藥物的協(xié)同作用并與臨床療效一致。5采用BIONUMERICSV461軟件應(yīng)用JACCARD和DICE方法對(duì)OPBG14和OPBG19引物擴(kuò)增的所有申克孢子絲菌菌株的RAPD帶型進(jìn)行聚類分析結(jié)果顯示國(guó)內(nèi)不同地區(qū)來源的申克孢子絲菌基因帶型呈現(xiàn)多樣性臨床耐藥株與敏感株在RAPD帶型及分組上未發(fā)現(xiàn)明顯聚類現(xiàn)象；不同臨床類型及不同部位分離的申克孢子絲菌其帶型及分組無明顯的聚類現(xiàn)象；6通過PCR方法采用所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增獲得與耐唑類藥物基因相關(guān)的申克孢子絲菌編碼細(xì)胞色素P450羊毛固醇14Α脫甲基酶的基因序列片段與白念珠菌ERG11基因的序列片段比對(duì)結(jié)果顯示具有高度一致的同源性。結(jié)論1從伊曲康唑治療失敗的孢子絲菌病患者皮損中分離的4株臨床耐藥株經(jīng)真菌形態(tài)學(xué)特征、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、電鏡和RDNAITS序列分析鑒定為申克孢子絲菌；2采用M38A方案和改良M27A2藥敏試驗(yàn)方案進(jìn)行的申克孢子絲菌菌絲相和酵母相體外單藥藥敏和聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中臨床耐藥株在致病相酵母相對(duì)伊曲康唑高M(jìn)IC結(jié)果證明其耐藥性；3申克孢子絲菌耐藥株的伊曲康唑和特比萘芬體外藥敏試驗(yàn)的聯(lián)合藥敏結(jié)果顯示具有協(xié)同作用且與相對(duì)應(yīng)的臨床療效一致體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)指導(dǎo)聯(lián)合治療具有一定臨床意義；4國(guó)內(nèi)不同地區(qū)來源的申克孢子絲菌基因的RAPD帶型呈現(xiàn)多樣性未發(fā)現(xiàn)地區(qū)集中現(xiàn)象同時(shí)臨床耐藥株與非耐藥株在帶型及分組上未發(fā)現(xiàn)明顯聚類現(xiàn)象；不同臨床類型及不同部位分離的申克孢子絲菌在其帶型及分組不存在明顯聚類；5通過所得的申克孢子絲菌編碼細(xì)胞色素P450羊毛固醇14Α去甲基化酶的基因序列片段可進(jìn)一步獲得該基因的全長(zhǎng)序列為該相關(guān)基因的耐藥機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。